• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        原位PCR和原位RT

        互联网

        1952
        相关专题
         
        (一)、仪器设备
        英国Thermo Hybaid原位PCR仪

        (二)、操作流程

        1、原位PCR 步骤
        1)预处理:
        (1)切片常规脱蜡;
        (2)0.2mol/L HCl处理10min;
        (3)5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min;
        (4)Nase消化组织37℃ 30min;
        (5)梯度酒精脱水,室温干燥。
        2)原位扩增:
        (1)切片滴加特异性序列引物30μLPCR 扩增反应液,覆盖硅化盖玻片,石蜡油封边;
        (2)PCR 热循环:94℃,1min;55℃,1min;72℃,1.5min,共25~30个循环,72℃延伸10min;
        (3)氯仿洗去盖玻片,4%多聚甲醛后固定10min,梯度酒精脱水,干燥。
        3) 原位杂交:
        (1)加地高辛标记探针的杂交液,98℃变性10min,-20℃退火5min,42℃杂交过夜。
        (2)杂交后用2×SSC洗涤10min,3次,1×SSC洗涤10min,3次;
        (3)缓冲液洗涤10min,3次;
        (4)加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物,37℃,2h;
        (5)缓冲液洗涤5min,3次;
        (6)NBT、BCIP暗处显色,镜下控制,终止显色。
        (7)常规脱水:透明、封固。

        2、原位RT-PCR步骤
        1)预处理:
        (1)蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min,蒸馏水洗;
        (2)95℃加热3min,灭活残存的蛋白酶。
        2)原位扩增:
        (1)在有RNA酶抑制剂存在的条件下,用随机六聚物进行逆转录反应;
        (2)用热启动法进行PCR扩增。标本加热至75℃时加上反应液,覆以盖玻片,四周用指甲油密封。然后将温度升至95℃,2min。再将热循环仪设定为95℃,45s,55℃,1min和75℃,45s,共26次循环;
        (3)扩增结束后,在80℃烤15min~30min。
        3)原位杂交:
        (1)杂交前标本95℃加热3min;
        (2)加上杂交液,湿盒内50℃过夜;杂交液组成:25%硫酸葡聚糖,2×SSC,50%甲酰胺,0.33mg/ml变性的鲑鱼精子DNA, 每0.5mL杂交液内含生物素标记探针1ng。
        (3)扩增的β-肌动蛋白和IL-6用DAKO检测试剂盒K600(链霉卵白素,生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝)检测。阳性反应呈紫色。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序