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        原位末端转移酶标记技术检测凋亡

        互联网

        2271

         

        (一)原理

         

        凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后,将DNA 切割成许多双链DNA 片段以及高分子量DNA 单链断裂点(缺口),暴露出大量3- 羟基末端,如用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT )将标记的dUTP 进行缺口末端标记,则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标记法。

         

        (二)荧光标记法

         

        1 .材料与试剂 采用德国Boehringer-Mannheim 公司In Situ Cell Death Detection 试剂盒,或美国Oncor 公司ApopTagTM 试剂盒,包括:

         

         

         

         

        ⑴生物素标记的-Dutp(Biotin-dUTP) 或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP)nmol/µl

         

        TdT 酶(25U/ μl

         

        ⑶ 反应缓冲液

         

        ⑷ 洗涤缓冲液

         

        ⑸ 异硫氰酸荧光素(FITC )标记的亲合素或链霉亲合素(2.5µg/ml )或抗地高辛抗体(130

         

        PI 染液(含PI 5µg/ml 及无DNA 酶活性的RNA0.1%

         

        PBS 缓冲液

         

        ⑻ 塑料盖玻片

         

        2. 样品

         

        ⑴ 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片

        ⑵ 贴壁生长的培养细胞

         

        ⑶ 冰冻切片

         

        ⑷ 常规石蜡切片

         

        3. 操作方法

         

        1 )固定:培养细胞的制片或冰冻切片用4% 多聚甲醛固定30min(4) 后,用80% 酒精再固定2h-20 ℃)。常规4% 中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。

         

        2 )洗涤:玻片浸入PBS 缓冲液,摇床上洗涤5min, 三次。

         

        3 )反应:洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分,按50 μl/2 滴加反应液(每50 μl 反应液含TdT0.5 μl, 标记的-dUTP 1 μl, 使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上, 盖上塑料盖玻片, 置湿盒中,37 ℃孵育1h

         

        4 )终止反应:去掉塑料盖玻片,将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内,洗涤两次,每次5min

         

        5FITC 标记:洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分,按50 μl/2 滴加FITC 反应液(含FITC 2.5 μg/ml ),室温下避光孵育10min

         

        6 )洗涤:将玻片置于洗涤缓冲液内,洗两次,每次5min

         

        7PI 复染:将玻片置于盛有PI 染液的染色缸内,室温下避光染色30min

         

        8 )封片:用盖玻片直接盖在含PI 染液的玻片上,亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘,置暗盒中,尽早镜检观察。

         

        4. 结果判定:用荧光显微镜观察,选用蓝色激发光(波长488nm ),所有的细胞核均被PI 着色,显示出红色荧光,而凋亡细胞被特异地标记上FITC ,显示出黄绿色荧光。

         

        ( ) 酶标记法

         

        1. 材料与试剂 采用美国Oncor 公司ApopTagTM -Peroxidase 试剂盒,包括:

         

        ⑴ 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体

         

        ⑵ 反应缓冲液

         

        TdT

         

        ⑷ 反应终止/ 洗涤液

         

        ⑸ 平衡缓冲液

         

        ⑹ 蛋白酶K 消化液:20 μg/ml 蛋白酶K 溶于PBS

         

        30% H2 O2

         

        DAB 显色液:0.05%diaminobenzidine(DAB) 溶于PBS ,用前过滤并加入

         

        0.02% H2 O2

         

        ⑼ 甲基绿染液:0.5% 甲基绿溶于0.1Mol/L 枸橼酸钠,pH 调整到4.0

         

        ⑽ 塑料盖玻片及玻璃盖玻片

         

        2 .样品 同荧光标记法。

         

        3 .操作方法

         

        ⑴ 固定:同荧光标记法。

         

        ⑵ 内源性过氧化物封闭 玻片置于盛有0.5% H2 O2 缓冲溶液的染色缸内,室温下作用20min 后,同荧光标记法洗涤。

        ⑶ 消化:玻片浸于盛有蛋白酶K 消化液的染色缸,室温下消化15min ,洗涤

         

        同上。

         

        ⑷ 平衡处理:将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干,滴加平衡缓冲液(按70µlcm2 )覆盖细胞或组织表面,盖上塑料盖玻片,室温下作用5min10min

         

        ⑸ 反应:移去盖玻片,倾去平衡液,用吸水纸吸干周围液体,滴加反应液(按50µl/2 18 μl TdT 36 μl 反应缓冲液),均匀覆盖在细胞或组织上,盖上塑料盖玻片,置于湿盒中,37 ℃温育1h

         

        ⑹ 终止反应:移去盖玻片,将玻片置于盛有终止/ 洗涤液的染色缸内,37 ℃下洗涤30min (置摇床上振摇)。然后将玻片置于洗涤缓冲液内,洗两次,每次5min

         

        ⑺ 地高辛抗体反应:用吸水纸吸干细胞或组织周围液体,滴加70 μl 过氧化物酶标记的地高辛抗体,均匀覆盖,加上塑料盖玻片,室温下置于湿盒中,孵育30min

         

        ⑻ 洗涤:置于洗涤缓冲液内,洗两次,每次5min

         

        ⑼ 用吸水纸吸干细胞或组织周围液体,滴加新鲜配制的DAB 显色液,均匀覆盖,加上塑料盖玻片,室温下作用3min6min

         

        ⑽ 洗涤:置于蒸馏水中洗涤3 次,每次3min6min

         

        ⑾ 套染:将玻片置于盛有甲基绿染液的染色缸中,室温染色10min

         

        ⑿ 洗涤:蒸馏水洗涤3 次(置于摇床上),每次2min

         

        ⒀ 脱水、封片:100% 正丁醇,3 次,每次2min 。二甲苯,3 次,每次2min

         

        明胶甘油封片。

         

        4 .结果判定 光学显微镜下观察,所有的细胞核均着绿色,凋亡的细胞核染色质显示出特异性的棕黄色。

         

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