cDNA文库组标准流程八:pBlueScript cDNA库扩增

 

1 ．试剂及配方：

2 x LB （1升）：

        20g    氯化钠

        20g    蛋白提取物

        10g    酵母提取物

      加入蒸馏水至1升，用NaOH调pH值至7.0，高压灭菌

2 x LB－甘油（12.5%）（200ml）

175ml  2 x LB液体

25ml   甘油（100％）

加入蒸馏水至200ml，压灭菌，置于4℃备用

 

2 ．步骤

1．将cDNA文库转入大肠杆菌，如DH5a(DH10B) 后，取少量菌液涂布氨苄平板，以推算克隆总量。

2．取一大小合适的三角瓶,根据克隆总量配制2 x LB液体，每500ml 2 x LB液体可扩增5x105个克隆，可以适当增加2 x LB液体的量，但不能少于此比例

3．按每100ml加0.3g的比例在2 x LB液体中加入SeaPrep agarose

4．70℃加热搅拌至琼脂糖溶解,高压灭菌后再70℃搅拌30分钟.

5．37℃放置1小时

6．加入适量安苄青霉素,使之终浓度为50ug/ml

7．加入全部菌液,并轻柔旋转使之混匀,避免振荡

8．将三角瓶置于冰水中1小时,水面必须没过三角瓶内液面

9．轻轻取出三角瓶,30℃培养40-45小时

10.将三角瓶内容物全部转入离心管中,离心10,000g ,20分钟,必须室温

11.弃上清,每100ml培养基离心得到的沉淀用10ml 2x LB－甘油（12.5%）重悬.

12.将重悬液留下10ul检测滴度,其余分装于1.5ml离心管,-80℃冰箱内保存

13.取1ul扩增后菌液倍比稀释.

14.各取10ul 稀释为10-5和10-6的菌液涂布于含安苄青霉素的LB固体平板上,37℃过夜培养,次日计算其克隆数以及扩增后总克隆数.