以 cDNA 为模板的 PCR 实验流程

以 mRNA 为模板，在反转录酶的催化下形成的互补DNA（complementary DNA）即为 cDNA，由于 cDNA 不像基因组DNA 那样有内含子，可以在原核生物中表达，基因蛋白编码序列的扩增、重组载体构建等常以 cDNA 为模板进行聚合酶链式反应。

获取不含内含子的 DNA 序列，用于可在原核生物中表达、扩增载体的构建。

1、在 0.2 ml PCR 管中配制 25 μL 反应体系：2.5 mmol/L dNTP 混合物 2 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，正向引物（10 μmol/mL）1 μL，反向引物（10 μmol/mL）1 μL，cDNA 模板 10-100 ng（X μL），DNA 聚合酶 1 U（0.5 μL），高压灭菌 ddH₂O 补齐至 25 μL。

2、按以下程序在 PCR 仪内进行扩增：① 94 ℃ 预变性 5 min，② 94 ℃ 变性 1 min，③ 55 ℃ 退火 1 min，④ 72 ℃ 延伸 2 min，⑤ 重复步骤 ②→④ 25~35 次，⑥ 72 ℃ 延伸 10 min。

3、用 1×TAE 溶液配制 0.8~1% 琼脂糖凝胶，25 μL PCR 扩增产物补加 3 μL 10 × Loading buffer 和 2 μL 高压灭菌 ddH₂O，恒压 80~120 V 跑琼脂糖凝胶。

4、凝胶成像仪器或紫外透射仪下观察电泳结果。

1、PCR 系统中的酶加入量为 1 个单位，注意购入酶的单位；

2、干粉引物拿到后低速离心后用高压灭菌 ddH₂O 稀释 10 μmol/mL；

3、退火温度根据引物序列按公式 Tm ＝ 2 ×（A + T）+ 4 ×（C + G）确定；

4、聚合酶链式反应循环中的延伸时间需根据序列长度和聚合酶效率确定。

1、PCR 产物的准确性

为确保序列准确性，DNA 序列需测序。

2、PCR 后无阳性条带

注意体系中酶的加入量是否过多；退火温度是否合适；循环中的延伸时间设计是否得当；是否漏加模板、引物或聚合酶。