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        lipofectamine 2000脂质体转染293ft细胞经验

        互联网

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        293细胞 总有一种转染方法适合你

        问: 我用lipofectamine 2000转染293ft细胞,细胞老是死亡,是什么原因?求各位先知不吝赐教。我的protocol如下:

        Day 0:细胞传代后计数、seed 2.0x105Cell s and 1.0x106 cells per well of plate

        Day 1:细胞达到70%汇合后准备:溶液1:200ul 无血清培养基 + 4 ul lipofectamine 2000 per well

        溶液2:200ul 无血清培养基 + 1 ug GFP per well

        将溶液1与溶液2混合,室温下置30min后加入600ul无血清培养基;PBS 冲洗细胞后每well加入500ul 混合的溶液。

        Day 2:18小时后用PBS冲洗细胞,加入含10%血清的培养基。隔天观察细胞绿色荧光。

        但是做到Day 1的时候,即加入lipofectamine后细胞就死亡了,后来老板说可能时间太长了,改18小时为4小时,但293ft细胞还是死亡。

        目前我人在德国做实验,德文的文献看不懂,所以请教各位不吝赐教!

        答1: 脂质体量多了,我们用说明书上的一半量,效果很好,但是质粒 要先测浓度.还有可能是时间久了,一般4-6小时后就要到掉脂质体,换为有血清和双抗的培养基,并且要用无双抗血清的培养基孵育lip5分钟以上

        答2: 建议用磷酸钙系统转染.通常293都是用该系统转染的,且效率很高,但要注意防止污染.2005年的Nature methods上有经典步骤.祝顺利!

        答3: 我个人也碰到类似的情况,曾与INVITROGEN的技术支持反映过此问题,对方的回应【原始邮件没有找到】认为主要是lipo2K的毒性问题,其中特别强调了:

        1. 取lipofectamine 2000时,一定要将lipofectamine 2000轻轻混匀,以确保你吸取的lipofectamine 2000浓度是正确的,不会过高或过低。当没有混匀,虽然你吸取的是4ul,但由于你吸取的lipofectamine 2000浓度可能较高,会造成严重的细胞毒性;

        2. 细胞密度问题:说明书上建议是细胞达到90%左右汇合时进行,这样可以减少lipo2K的毒性。如果细胞密度较低,如70%,会造成较为严重的毒性,而使细胞死亡。

        同时个人建议:

        1. 由于293的转染效率非常高,细胞生长也非常旺盛,因此,打到95%左右汇合时转染,可能时比较高的平衡点(细胞毒性与转染效率的平衡点)

        2. 转染时间4h没问题。

        3. 你没有说你是用什么培养板,500ul/well,可能是24well-plate。如果不是,应该按说明书进行,英文版的说明书可以在invitrogen上下载;

        4. lipo2K转染时的培养基是可以含血清的,如果上述建议仍然无效,你可以试试,将“转染混合液”加入含有血清的培养基培养的293细胞孔中。【配制转染混合液还是用无血清的,最好是opti-mem。

        如果是6孔板,你转染混合液加入的是每孔500ul,这样的体积对6孔板而言,几乎是可以覆盖细胞单层的下限,有可能会造成孔中央的细胞缺乏培养基。因此,建议你还是按说明书的来,2ml/well。

        在你没有得到好结果前,我个人觉得要认真按说明书进行,而不要根据自己的臆想进行所谓的优化实验,更改参数。

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