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        脂质体转染法

        相关实验:DNA 转染实验

        别名:transfection,基因转染

        最新修订时间:

        简介

        运用物理或化学方法将外源 DNA 导入细胞的过程,称为 DNA 转染或基因转染(transfection)。采用该技术,既可将外源基因导入体外生长的细胞,用于研究基因的表达调控,亦可将外源基因导入体内细胞,用于基因治疗。

        脂质体转染法操作简单,无需昂贵的仪器设备,成本较低,已被许多实验室广泛采用。

        原理

        脂质体转染法的原理是脂质体(liposomes)是由脂质双分子层组成的、内部为水相的闭合囊泡结构。在脂质体的水相和膜内可包裹多种物质。DNA 与脂质体混合后可被包裹在脂质体的水相中。当脂质体与转染细胞的细胞膜相接触时,其脂质双分子层与细胞膜融合,脂质体水相中 DNA 进入细胞内部,细胞被转染。

        材料与仪器

        器材:

        ① 1.5 ml Eppendorf 管

        ② 20 μl 微量移液器

        ③ 100 μl 微量移液器

        ④ 2 ml 移液器


        ⑤吸头、吸管、吸水滤纸

        ⑥CO2 培养箱

        ⑦倒置显微镜

        ⑧荧光显微镜(450~490 nm)

        ⑨离心机、天平

        试剂:

        ①材料:35 mm 培养皿培养的 HeLa 传代细胞、无血清 MEM 培养液稀释的 pCMV-GFP 质粒 DNA(2 μg / 100 μl)、无血清 DMEM 培养液稀释的脂质体 Lipofectin(2 μg/μl)


        ②无血清 DMEM 培养液


        ③胰蛋白酶溶液

        ④含 10% 小牛血清的 MEM 完全培养液

        步骤

        脂质体转染法的基本过程可分为如下几步:

        (1)转染前 24 h,用胰蛋白酶溶液消化收集 HeLa 细胞培养物,以 5x104 个/平皿的细胞密度平铺细胞于 35 mm 组织培养皿上,加入 3 ml 含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养基置于 5%~7% CO2 的 37℃ 温箱内孵育。

        (2)配制溶液 A 和溶液 B。溶液 A:取 2 μg pCMV-GFP 质粒 DNA 用 100 μl 无血清无抗生素培养液稀释(2 μg / 100 μl)。溶液 B:取 20 μl 脂质体 Lipofectin(2 μg/μl)用 100 μl 无血清无抗生素培养液稀释。

        (3)室温下孵育 10 min。

        (4)将溶液 A 逐滴加入溶液 B 中,用吸管吹打几次混匀,并于室温下孵育 10 min。


        (5)取出 HeLa 细胞培养皿,用无血清培养液将培养皿内细胞反复洗涤(400 g,离心 3 min,弃上清液)3 次。最后,加入 0.5 ml 无血清培养液,暂置于 5%~7% CO2 的 33℃ 温箱内孵育。

        (6)DNA- 脂质体混合液孵育 10 min 后,取 0.8 ml 无血清培养液加入混合液中,混匀,室温下再孵育 10 min。

        (7)将孵育后的 DNA- 脂质体混合液移至 HeLa 细胞培养皿中,置于 5%~7% CO2 的 33℃ 温箱内孵育 5 h。

        (8)取出 HeLa 细胞培养皿,再用无血清的培养液将培养皿内细胞反复洗涤(400 g,离心 3 min,弃上清液)3 次。最后,加入 3 ml 含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养基,置于 5%~7% CO2 的 33 ℃ 温箱内孵育 24~48 h。

        (9)24 h 后,在 450~490 nm 波长的光下用荧光显微镜观察 HeLa 细胞的转染率和荧光强度。

        (10)记录、分析实验结果。

        注意事项

        (1)传代细胞的准备细胞在转染前 24 h 传代,待细胞密度达 60%~75% 满皿底时即可进行转染。如果转染前细胞生长不足 12 h,细胞就不能很好地吸附在培养皿上,与脂类接触时易于脱落。

        (2)用 Lipofectin 转染时,不要用聚丙烯试管,因为 Lipofectin 中的阳离子脂类会与聚丙烯发生非特异性结合,而影响转染结果。

        (3)在添加 DNA- 脂质体混合液前,用无血清培养液充分洗涤待转染细胞很重要,因为血清会强力抑制转染;有些胞外基质复合物,如硫酸蛋白聚糖,也可抑制转染。

        (4)GFP 表达的影响因素主要与转染时的温度、pH 值和观察时间有关。同一表达载体转染同一种细胞后,分别在 33 ℃ 和 37 ℃ 条件下培养,则 33 ℃ 条件下培养者可观察到较强的荧光,而 37 ℃ 条件下培养者荧光较弱,其原因可能是 37 ℃ 时三肽环状结构不易形成。培养液的 pH 值也显著影响 GFP 的荧光特性,转染后的细胞于 33 ℃、5% CO2 条件下培养,在培养液为碱性时荧光较强,培养液为酸性时荧光减弱。荧光强度一般在转染后 48 h 最强,这可能是一方面与 GFP 的表达量有关,另一方面与细胞的生长状态有关。因此,在实验中应严格控制转染时的温度、pH 值和观察时间,以获得较好的实验结果。

        来源:丁香实验

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