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        【求助】有使用过试剂盒检测Rho活性的同仁吗?快来指导下我~~

        丁香园论坛

        2208
          试剂盒才买回来,是upstate的那个,rho activation assay kit研读说明书中,我以前从没做过pull down assay的,同实验室也没师兄师姐做过...所以,基本等于小白一个
          问题是这样的,在rho pull down assay的这个步骤中,最后要求短暂离心收集管底物质。在免疫分析这一步又要求讲上清和琼脂糖珠混合,把我弄糊涂了,那前一步收集的管底物质是干什么的?
          试剂盒很贵,实在不敢浪费,请大人们指教了~
        附上说明书相关步骤的截图~
        这个步骤就象IP一样,你可以找下关于IP assay方法学习下就知道什么意思了。
        我去找了IP的方法学习,结果越学越糊涂,附上upstate这个试剂盒的说明书,希望能有人抽出时间看看,帮帮我这个菜鸟
        问题还是在D.Rho pull down assay这一部分上,其中步骤2加Rho assay reagent(Rhotekin RBD,agarose),这个东西是不是就起到琼脂糖珠子的作用?
        步骤8,离心后收集管底沉淀,收集的应该就是琼脂糖珠子吧?这个收集了之后有什么用呢?
        然后,E部分的第一步,要求将上清和琼脂糖球混合用以电泳,那这个上清是哪来的上清呢?是不是D步骤中第8步离心后的上清?这里的琼脂糖球是指?
        请达人给我具体讲讲这几步吧,困扰我好几天了~~~
        Rho assay reagent应该是终止活性反应的。步骤8收集的是珠子,IP试验应该你看到了,珠子上有你需要的蛋白。E中所说的应该是收集的bead喝上清是上样缓冲液和bead的混合物。
        谢谢楼上的~我看的关于IP的教程中,有收集珠子,用上清跑电泳的,也有把珠子和2xSDS上样缓冲液一起煮5min,一起跑电泳的...@_@
        可能我太笨了,还是有些不明白,现在问题在E1,收集的珠子,到底是和D8中离心后的上清重新混合,还是和新的上样缓冲液混合呢?
        我觉得是和上样缓冲液混合后的体系。
        dianaofyezi wrote:
        我觉得是和上样缓冲液混合后的体系。

        您的意思是新的上样?
        简单的说就是将你收集的bead当做PAGE的样品。原来你如何做WB就按照步骤做就可以了。只是原来的样品是蛋白或者其他这里是bead而已。不知道你能明白我的意思否?

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

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