Caspase-1 活性检测

Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease) 是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase-1 主要参与促炎细胞因子的激活和细胞凋亡过程。FAM-YVAD-FMK 试剂旨在通过测量活细胞中的 caspase 1 活化来检测细胞凋亡。

Caspase 活性检测基于 Caspase 的荧光抑制剂，这些抑制剂具有细胞渗透性和非细胞毒性。一旦进入细胞，Caspase 抑制剂与活性 Caspase 共价结合。已经证明 Caspase-1 对肽序列 Tyr-Val-Ala-Asp（YVAD）具有底物选择性。使用 FAM-YVAD-FMK 作为 Caspase-1 活性的荧光指示剂。

FAM-YVAD-FMK 在凋亡细胞中不可逆地结合活化的 Caspase-1。 一旦与 Caspase-1 结合，荧光试剂保留在细胞内。FAM 标签允许通过荧光显微镜、流式细胞术或荧光读板器直接检测凋亡细胞中活化的半胱天冬酶。

FAM 荧光光谱图

对于其他 Caspase 活性检测可以选用相应荧光试剂：

Poly Caspase FAM-VAD-FMK

Caspase-1, 4, & 5 FAM-YVAD-FMK 

Caspase-1, 4, & 5 FAM-WEHD-FMK

Caspase-2 FAM-VDVAD-FMK

Caspase-3/7 FAM-DEVD-FMK 

Caspase-6 FAM-VEID-FMK

Caspase-8 FAM-LETD-FMK

Caspase-9 FAM-LEHD-FMK

1、根据特异性诱导方案，将细胞培养至最适于细胞凋亡诱导的密度，但不超过 2x10⁶ 个细胞/mL。同时，培养非诱导的阴性对照细胞群时与诱导组在密度上保持一致。

2、通过向 FAM-YVAD-FMK 的小瓶中加入 50 μL DMSO 制备 150× FAM-YVAD-FMK DMSO 储备溶液。

3、将 150× FAM-YVAD-FMK DMSO 储备溶液以 1:150 的比例添加到细胞溶液中，并将细胞在 37 ℃，5％ CO₂ 培养箱中孵育 1 小时。

4、将细胞以约 200 g 旋转 5 分钟，并用 Hepes 缓冲液洗涤细胞两次。将细胞重悬于所需量的洗涤缓冲液中。

5、如果需要，用 DNA 染色标记细胞（如用于死细胞的碘化丙锭，或用于细胞核染色的整个群体的 Hoechst）。

6、通过荧光显微镜，流式细胞仪或荧光酶标仪在 Ex / Em = 490 / 525 nm 处检测荧光强度（对于碘化丙锭，Ex / Em = 535 / 635 nm; 对于 Hoechst 染料，Ex / Em = 350 / 461 nm）。

（1）对于流式细胞仪，使用 FL1 通道监测荧光强度（FL2 通道用于碘化丙锭染色）。

（2）用于荧光显微镜和荧光酶标仪。将 100 μL 细胞悬浮液置于 96 孔黑壁/微量滴定板透明底部的每个孔中。

（3）使用 FITC 通道在荧光显微镜下观察细胞（用于碘化丙啶染色的 TRITC 通道，用于 Hoechst 染色的 DAPI 通道）。

（4）使用荧光酶标仪，使用 Ex / Em = 490 / 525 nm（在 515 nm 处截止）底部读取模式监测荧光强度。

1. 应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的最佳细胞密度。

2. 对于 FAM-YVAD-FMK 标记，细胞可以浓缩至 ~ 5×10⁶ 个细胞/mL。未使用的 150× FAM-YVAD-FMK DMSO 储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在 -20 ℃；

3. 对于贴壁细胞，用 0.5 mM EDTA 轻微消化细胞以保持细胞完整，并在用 FAM-YVAD-FMK 孵育之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。

4. 适当的孵育时间取决于所用的细胞类型和细胞浓度。优化每个实验的孵育时间。

5. 如果需要平衡细胞浓度，调整诱导细胞的悬浮体积以接近非诱导细胞群的细胞密度。如果您的细胞治疗不会导致受刺激细胞群数量的显着损失，则此调整步骤是可选的。

6. FAM-YVAD-FMK 是荧光的，因此清除任何未结合的试剂以消除背景非常重要。

7. 对于分离的细胞，应将细胞浓度调节至每个微量滴定板孔中 2~5×10⁵ 个细胞/100 μL 等分试样，用于步骤 6。

诱导悬浮培养细胞凋亡的方案？

常见诱导方案如下：

（1）用 2 μg/ml 喜树碱处理 Jurkat 细胞 3 小时。

（2）用 1 μM 星形孢菌素处理 Jurkat 细胞 3 小时。

（3）用 4 μg/ml 喜树碱处理 HL-60 细胞 4 小时。

（4）用 1 μM 星形孢菌素处理 HL-60 细胞 4 小时。