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        巴傲得生物-WB实验流程

        互联网

        2204

        凝胶浓度与蛋白质分离范围

        凝胶浓度% (W/V

        最适分离范围(KD

        7.5

        70-200

        10.0

        50-150

        12.0

        30-100

        15.0

        12-45

        20.0

        4-30

        不同浓度分离胶的制备(两块胶)

        组分

        7.5

        10

        12

        15

        20

        Tris-HCL 缓冲液

        3.75ml

        3.75 ml

        3.75 ml

        3.75 ml

        3.75 ml

        蒸馏水

        7.28 ml

        6.03 ml

        4.95 ml

        3.45 ml

        1.0ml

        丙烯酰胺溶液, 30 10

        150.0 μ l

        150.0 μ l

        150.0 μ l

        150.0 μ l

        150.0 μ l

        过硫酸胺, 10

        150.0 μ l

        150.0 μ l

        150.0 μ l

        150.0 μ l

        150.0 μ l

        TEMED

        15.0 μ l

        15.0 μ l

        15.0 μ l

        15.0 μ l

        15.0 μ l

        1.5mol/L Tris-HCL pH8.8

        0.8g 甲撑双丙烯酰胺/100ml 水。

        4 �浓缩胶的制备(两块胶)

        组分

        体积

        Tris-HCL 缓冲液

        1.25 ml

        蒸馏水

        3.05 ml

        丙烯酰胺溶液, 40

        0.67ml

        SDS 10

        50 μ l

        过硫酸胺, 10

        50.0 μ l

        TEMED

        10.0 μ l

        0.5mol/L Tris-HCL pH6.8

        试剂配制:

        1 10%APS

        1g 溶于 10ml 水,小管装,外包铝箔

        2 Tris HCl ph8.8 1.5M

        18.171g Tris-base 溶解到 60ml 水,调节 PH 8.8 ,定容到 100ml

        3 Tris HCl ph6.8 0.5M

        6.057g Tris-base 溶解到 60ml 水,调节 PH 6.8 ,定容到 100ml

        4 10 × TBS PH7.6

        NaCl 80g

        Tris-base 24.2g

        HCl PH 7.6 ,超纯水定到 1L

        5 TBST (现用现配) 存放于 4 度冰箱

        10 × TBS 50ml 450ml 水; 500 微升 Tween-20

        6 2 × Loading Buffer 100ml

        0.5M Tris HCl ph6.8 20ml; 甘油 20ml; 10%(W/V) SDS 40ml; 2- β - 巯基乙醇 10ml; 0.1%(W/V) 溴酚蓝 5ml; ddH2 O 5ml

        7 10 × Transfer Buffer 1L

        144g Glycine

        30.3g Tris-base

        定容到 1L , 用时稀释到 1 ×

        8 10× SDS Buffer 1L

        144g Glycine

        30.3g Tris-base

        10g SDS

        定容到 1L , 用时稀释到 1 ×

        9 封闭液

        5% W/V )脱脂奶粉,用 TBS 稀释

        10 一抗稀释液

        2% W/V BSA ,用 TBST(0.1% V/V Tween-20) 稀释

        11 二抗稀释液

        2% W/V )脱脂奶粉,用 TBST(0.1% V/V Tween-20) 稀释

        提取蛋白:

        1 把培养皿置于冰上,倒掉培养液,并用 PBS 洗涤细胞,然后弃去洗液。

        2 1ml 细胞裂解液(配方如下所示)加入培养皿,晃匀置于冰上 30min ,每 5min 晃一次。

        3 裂解完后,用干净的刮子将细胞刮于培养皿的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)

        4 将收集下来的细胞于 4 度下 12500rpm 离心 15min

        5 将离心后的上清加入等体积的 2 × loading buffer ,煮沸 5min

        1ml 细胞裂解液:

        0.5ml

        0.5ml 裂解液

        10µl 蛋白酶抑制剂

        10µl Na2VO3 100mM

        1µl 胃蛋白酶抑制剂( pepstatin

        其中:

        一, 裂解液( calbiochem 100ml

        NaCL 1.578g

        β-gly 1.08g

        Tris 0.485g

        EDTA 0.1489g

        sp (焦磷酸钠): 0.1784g

        DTT( 二硫代苏糖醇 ) 0.0617g

        Triton-100 2ml

        甘油: 20ml

        HCL pH 7.5 ,定容至 100ml

        二,蛋白酶抑制剂

        亮肽酶素( leupeptin ): 1mg/ml (用水溶解,终浓度 1µg/ml

        抑酞酶( aprotinin ): 1mg/ml (用水溶解,终浓度 1µg/ml

        即,将 1mg leupeptin 1mg aprotinin 溶解在 1ml 水中,稀释 10 倍后分装( 20µl 一管)并储存于 -20 度,每用一次拿出一管。

        三,胃蛋白酶抑制剂( pepstatin ):

        1mg/ml (用乙醇溶解,终浓度 1µg/ml ),储存于 -20 度。

        四, Na2VO3 储存于 4 度。

        煮样

        将等体积的 2 × Loading Buffer 加入到细胞裂解液中(即, 2 × Loading Buffer :样品 =1 1 ),在沸水浴中煮沸 5min ,防止爆盖。煮沸后在离心机上瞬时甩一下,保证样品充分混匀。

        电泳

        浓缩胶 4% ,分离胶 12% (小分子为: 15% );

        电泳: 85V 跑至 marker 出现分离, 135V 溴酚兰刚跑出胶板。;

        转膜

        转膜:恒流 0.35A 100min 0.45 微米孔径的 NC 膜,(小分子为:恒流 0.3A 60min 0.22 微米孔径的 NC 膜);要在冰浴中进行(转移前将胶和膜在转移缓冲液中浸泡 20min )。

        注意:转膜时两份滤纸不能接触,否则会短路,电流不会过胶和膜!

        封闭

        5% 脱脂奶粉( TBS 配置);室温 1 小时;

        TBST 洗膜 3 次,每次 5min

        孵育一抗

        1 500 2%BSA TBST 配制), 4 度过夜;

        TBST 洗膜 3 次,每次 5min

        孵育二抗

        羊抗兔,荧光二抗( 1 5000 2% 奶粉 TBST 配制);室温 1-2 小时避光;

        TBST 洗膜 3 次,每次 5min, 最后超纯水洗膜 1 次, 5min

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