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        【Go】我的 WB 经验分享,快来帮我点赞吧!

        相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

        最新修订时间:

        简介

        我的 WB 经验分享,快来帮我点赞吧!

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        原理

        采聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测的物质是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜上),固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变,以固相载体上的蛋白或者多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应。

        再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或者放射自显影以及检测电泳分离的特异性目的蛋白的表达成分。该技术广泛应用于蛋白表达水平的检测。

        材料与仪器

        电转夹、聚丙烯酰胺凝胶等。

        步骤

        实验流程:

        蛋白样品的制备(裂解细胞)——制胶——上样及电泳——转膜——分别加入一抗、酶标二抗。

        具体实验步骤:

        1、细胞裂解进行蛋白提取的步骤同 COIP 细胞裂解的步骤。

        2、制胶:电泳的过程中需要配置分离胶和浓缩胶,每一个胶板大致配 7—8mL 的分离胶,3-4mL 的浓缩胶。(先配分离胶再配浓缩胶)。将配置好的分离胶加入到两玻璃之间,注意加入的位置,然后在其上加入 75% 的乙醇,待其自然凝固后将其中的乙醇倒掉,用水轻轻的冲洗,再将浓缩胶倒入其中让其慢慢凝固。(不要忘记插梳子,若不立即进行电泳则需要先将配置好的胶板放到冰箱中防止其变干。)

        3、为了防止电泳过程中条带的弯曲,在安装电泳仪之前要用两个胶板固定使其平衡。玻璃板低的一侧朝向里面,注意电极正负,电泳之前要在电泳槽中倒入电解液(电解液使用次数最好不超过三次)

        4、上样之前要进行上样量的计算,要使所有样品的上样量都保持一致,控制单一变量(总体积和上样量保持一致)。上样之前蛋白需要进行煮沸,使蛋白裂解。煮沸过之后用小的离心机稍微离心。

        5、上样及电泳;先加入 Buffer,然后依次的加入样品,最后加入 2-3uL 的Marker。打开电源,调至电压至 100V,待 Marker 条带分明时(大概需要30min),然后将电压调至 150V,至 Marker 中的红色条带跑到下面为止。

        6、转膜:膜需要先用甲醛进行活化,电转液需要提前配置进行预冷。转膜之前膜和胶之间不要有空隙。电压 100v,电流不能超过 400,进行 50 或 60min 。

        7、封闭完之后,加入抗体进行封膜处理,封膜1h。(注意:封膜之前要将里面的气泡赶走,以免影响抗体孵育。)

        8、取出膜用 TBST 洗3次,每次 10 min。

        9、加入二抗进行孵育,步骤同 7。孵育 1 h。 孵育过之后用 TBST 清洗三次。

        10、暗室显影:加入和二抗结合的AB液,(主要的目的是与二抗结合发出荧光)。

        注意事项

        1、电转液需要提前遇冷

        2、孵抗体的时候要将气泡赶走

        常见问题

        转膜的时候为什么 Marker 有时会模糊?

        在进行转膜的时候一定要将电转液放在冰上进行提前遇冷,电转的过程中电流不要过高。

        来源:丁香实验

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