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        巴傲得生物,WB过程中常见的问题及可能原因分析

        互联网

        3010

        WB 过程中常见的问题及可能原因分析

        问题

        可能原因

        验证或解决办法

        背景高

        膜没有完全均匀湿透

        使用 100% 甲醇浸透膜 5-10min

        洗膜不充分

        增加洗液体积和洗涤次数

        阻断不充分

        增加封闭液孵育时间,或者提高温度。选择合适的封闭试剂(脱脂奶粉, BSA ,酪蛋白等)

        二抗浓度过高

        降低二抗浓度

        检测过程中膜干燥

        保证充分的反应液,避免出现干膜现象

        曝光过度

        缩短曝光时间

        抗体与阻断蛋白有交叉反应

        检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应

        没有阳性条带,或者阳性条带比较弱

        抗体染色不充分

        增加抗体浓度,延长孵育时间

        酶失活

        直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物

        标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

        设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。

        试剂不匹配

        一抗与组织种属,一抗与二抗或 / 和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性

        一抗失效

        选择在有效期内抗体;并选择现配现用的工作液

        HRP 抑制剂

        所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

        膜没有完全均匀湿透

        使用 100% 甲醇浸透膜

        靶蛋白分子量小于 10Kd

        选择小孔径的膜,缩短转移时间

        甲醇浓度过高

        过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离,从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替

        转移时间不够

        对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间

        抗体染色不充分

        增加抗体浓度,延长孵育时间

        标本中靶蛋白含量太低

        增加标本上样量。

        HRP 抑制剂

        所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

        抗体活性降低

        选择在有效期内的抗体,工作液现配现用,避免长时间放置

        封闭过度

        减少封闭剂的量或缩短时间;换用不同封闭剂类型

        曝光时间过短

        延长曝光时间

        条带位置不对;或有非特异性条带

        色带)

        二抗的非特异性结合

        增加一个对照:不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗(特异性更强的,只针对重链的)

        一抗的特异性不够

        使用单克隆或者亲和纯化的抗体,保证抗体的特异性

        蛋白降解

        使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂

        二聚体或多聚体存在

        增加蛋白质变性过程及强度

        抗体浓度过高

        降低抗体(一抗、二抗)浓度,可以减少非特异性条带

        蛋白上样量过大

        降低上样量

        封闭剂中有聚集体

        使用前过滤封闭试剂

        HRP 耦联二抗中有聚集体

        过滤二抗试剂,去除聚集体

        HRP 含量过高

        降低酶联二抗的浓度

         

         

         

         

         

         

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