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- 2026年04月02日
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蛋白质免疫印迹法 (Western Blot ) ，简称WB ，是指通过SDS-PAGE胶将不同分子量的蛋白质分离开，然后将目标蛋白转移到载体(PVDF)膜上，利用抗原抗体的特异性结合，用特异性的一抗结合目标蛋白，用HRP标记的二抗结合一抗，再加以ECL发光液显色，检测组织或者细胞内某种或者某些特异性蛋白质的表达。蛋白质免疫印迹是做蛋白质分析的一种常规技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析，还可以用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。
实验流程：
蛋白提取-制胶-电泳-转膜-封闭-一抗孵育-二抗孵育-化学发光-结果分析;
送样要求：新鲜组织：
0.1g新鲜组织至少、液氮或-80℃保存、干冰运输
细胞样本：
1、贴壁细胞：每1×106个细胞（至少）
胰酶消化：吸去培养板内的培养基，用胰酶将细胞消化后，收集到15ml或者50ml离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清；加入PBS轻轻吹打，1500rpm离心3min，弃去上清；反复3次，弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况一般保存1年，建议尽快检测。
细胞刮子收集细胞：对于某些蛋白（即对胰酶比较敏感或者实验特殊要求，如E-Cadherin不易用胰酶消化后进行WB检测），直接用细胞刮子刮下细胞，收集到EP、15ml或者50ml离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清；加入PBS轻轻吹打，1500rpm离心3min，弃去上清；反复3次，弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用，建议尽快检测。
2、悬浮细胞样品：把细胞及培养液一起收集到15ml或者50ml离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清；加入PBS轻轻吹打，1500rpm离心3min，弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。避免冻融，尽快检测
提供结果示例：
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文献和实验免疫印迹又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中 的某种蛋白的方法。其基本流程是先将待检测样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分离各组分，然后通过印迹技术把分离样品几乎原位、定量转 移到 NC 膜上。随后用特异抗体与 NC 膜上的靶抗原反应，结合上的抗体可用与辣根过氧化物 酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白进行反应，最后通过与酶的底物发生显色反应来做检测。 由于免疫印迹具有 SDS
western blot是现在实验技术中较常用但又不好控制的实验技术。近一月，一直在攻克这个高地，目前尚在努力中，有些心得想给大家聊聊。希望对大家的实验有点点帮助。1)蛋白提取和定量：A.组织蛋白提取过程中，匀浆是一个多因素影响的过程，除了根据实验目的要加入各种蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等之外，匀浆操作本身也有讲究。在其他条件都一致的情况下，匀浆操作尽量是一个人进行（手法一致，否则蛋白浓度和含量有差异）。B.所提取的蛋白，要注意分装、低温保存，或者100度加热制备成样品。C.蛋白定量，采用
要。但是在做WB实验的7、8个月过程中，我的核心的一个蛋白一直处于混沌状态，可能跑30次能现身一次，现身之后又没影好几个月，就这样捉摸不定，搞得我很烦，但又无可奈何。询问了实验室的同学们，说法各一：1、有人说小分子量蛋白就是难跑，为什么难大家也说不清楚。2、有的说分泌性蛋白本身胞内含量少，不好跑，需要加大上样量，似乎也是实话。3、还有的说小分子量蛋白容易降解，你的蛋白质降解了吧，我姑且信了。但是95%的时候我跑出的条带都是大白板，纵然我通过PCR、细胞的免疫荧光都能够发现这个蛋白，但是就是WB做不出
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