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        利用CTAB法提取植物基因组DNA

        互联网

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        一、实验原理
        CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种去污剂,可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物,该复合物在高离子强度(0.7mol/L)的溶液里是可溶的,通过离心可将复合物同蛋白质、多糖类物质分开。在酚仿变性的条件下,去除残留的CTAB和蛋白质等杂质,然后利用异戊醇或无水乙醇将DNA分子从上清溶液中沉淀出来,最后用TE溶解DNA,并加入RNA酶以去除基因组中的RNA,置于-20℃备用。因此,CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体中提取核酸,例如:植物的叶片组织。

        二、实验材料及试剂
        1. 实验材料:新鲜植物叶片。

        2. 试剂 与溶液:

        CTAB提取缓冲液,Tris-饱和酚,氯仿-异戊醇(24:1),异丙醇,70%乙醇,含RNase 的TE溶液。
        CTAB提取缓冲液:2%(M/V) CTAB,1.4M NaCl,100mM Tris-Cl(pH8.0),20mM
        EDTA,pH 8.0,2%(V/V)β-巯基乙醇(使用前加入)。

        三、实验步骤
        1. 取0.5 g 新鲜植物叶片置于研钵中,加入适量液氮,迅速研磨成均匀粉末。

        2. 将粉末移入1.5mL 离心管 ,加入800μL CTAB分离缓冲液,上下颠倒 离心管 ,混合均匀。

        3. 将盛有样品的离心管置于65℃ 水浴 中保温30min,其间每隔3-4min 轻摇混匀。低温12000rpm离心5min,将上层水相转移至新的离心管中。

        4. 加入等体积的Tris-酚和氯仿异戊醇,上下颠倒离心管,混合均匀;低温12000rpm离心5min,将上层水相转移至新的离心管中。

        5. 加入等体积的氯仿异戊醇上下颠倒离心管,混合均匀;低温12000rpm离心5min,将上层水相转移至新的离心管中。

        6. 加入0.6倍体积的异丙醇,轻轻混匀,置于-20℃沉淀30min。

        7. 低温12000rpm离心5min去上清,加入500μL 70%乙醇洗涤沉淀,常温12000rpm 2min,去上清,沉淀尽量干燥。

        8. 加入适量含有RNase的TE(20μL)溶解沉淀,37℃ 水浴 30min,消化RNA。

        9. 取适量基因组DNA样品,电泳检测。

        四、注意事项
        1. Tris -酚,氯仿和β-巯基乙醇均为有毒试剂,使用时小心,切勿接触皮肤。

        2. 实验材料要新鲜。

        3. 液氮研磨要充分,研磨过程中可补充液氮继续研磨。

        4. 酚氯仿抽提时离心时间可长些,取上清时不要触及蛋白层。

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