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        CTAB法提取植物总DNA

        互联网

        7431
        实验概要

        CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法,通过实验掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
         
         
        实验原理

        CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。采用机械破碎植物细胞,然后加入CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来,再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质,最后得到DNA。
         
         
        主要 试剂

        2×CTAB提取缓冲液  [ 详细信息:100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 2%(w/v)CTAB,40mmol/L 巯基乙醇(随用随加) ]
        TE 缓冲液 [ 详细信息:10mmol/L Tris-HCL  (pH7.4),1mmol/L EDTA ]
        氯仿-异戊醇(24 :1)
        70% 乙醇
        液氮
         
        主要设备

        冷冻高速离心机
        台式高速离心机
        移液器
        水浴锅
        陶瓷研钵
        离心管 [ 详细信息:50ml,有盖 ]
        离心管 [ 详细信息:5ml和1.5ml ]
        小玻棒 [ 详细信息:形状为弯成钩状的 ]
         
        实验步骤

        1. 取1-50g新鲜植物材料,于液氮中研成粉。
        2. 将冻粉转入预冷的 离心管 中,立即加入等体积(w/v) 2×CTAB提取缓冲液,65℃保温10-20分钟,其间不时摇动。
        3. 加入等体积的氯仿/异戊醇,轻缓颠倒 离心管 混匀,室温下,12000r/min 离心10-20分钟。
        4. 将上清液转入另一离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇,颠倒离心管混匀,室温、12000r/min 离心10分钟。
        5. 将上层水相转入新的经硅烷化处理的离心管中,加入0.6-1倍体积的异丙醇,混匀,室温下放置30分钟。
        6. 3500-4000r/min 离心5-10分钟,去上清液, 70%乙醇漂洗,沉淀吹干。
        7. 风干后加入40ul的TE 缓冲液 溶解DNA,-20℃保存备用。。
        8. 取2ul溶液电泳检测。
         
         
        注意事项

        所有操作均须温和,避免剧烈震荡。
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