已知基因序列的获取策略――兼谈引物设计与序列分析

真核表达载体的选择

-Promoter

Conventional/Tissue-Specific/Inducibl

-Poly (A) tail

-Kozak序列：－9GCCGCCA/GCCAUGG＋4

一个载体内的多基因表达

-IRES系统

-加linker直接融合表达

-多个独立的表达 cassettes：优于共转染表达

-SOE技术与基因人工合成及多基因融合

-基因设计与人工合成中的密码子优化

DNAWorks 2.4 (Hoover, D. and Lubkowski, J., 2002)http://mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/

SOE：Spliced by overlapping extension

搭桥技术融合基因

一、引物设计

引物设计的3条基本原则：

-引物与模板的序列要紧密互补

-引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，

-引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

引物设计注意事项

-引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38bp。

-引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。

-引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。

-5’端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5‘端限制酶位点外再加1-3个保护碱基。

-简并引物：应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3’端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

-同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。

-GC含量：一般为40-60%。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。

-Tm值：引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。有多种计算方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在软件中常使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。

-△G值：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

Primer Premier 5.0

引物设计

限制性内切酶位点分析

DNA基元(motif)查找

同源性分析

Oligo6.69

二、测序图比对、拼接与虚拟克隆(in silico cloning)

常用本地软件：Clone manager、Vector NTI、DNAstar和ds-Gene等

在线工具：BLAST等

常用序列拼接软件

-DNAstar 的SeqMan模块

-VectorNTI程序的Contig Express模块

-Sequencher

导入后可以双击查看和编辑各个测序结果

选择序列，根据实际情况调整序列末端

选择序列拼接

双击查看结果

输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧。

输出结果

真核表达载体的选择
-Promoter
Conventional/Tissue-Specific/Inducible
-Poly (A) tail
-Kozak序列：－9GCCGCCA/GCCAUGG＋4

一个载体内的多基因表达
-IRES系统
-加linker直接融合表达
-多个独立的表达 cassettes：优于共转染表达
-SOE技术与基因人工合成及多基因融合
-基因设计与人工合成中的密码子优化
DNAWorks 2.4 (Hoover, D. and Lubkowski, J., 2002)http://mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/
 

SOE：Spliced by overlapping extension
搭桥技术融合基因

三、引物设计

引物设计的3条基本原则：
-引物与模板的序列要紧密互补
-引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，
-引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

引物设计注意事项
-引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38bp。
-引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
-引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
-5’端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5‘端限制酶位点外再加1-3个保护碱基。
-简并引物：应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3’端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
-同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
-GC含量：一般为40-60%。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。
-Tm值：引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。有多种计算方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在软件中常使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。
-△G值：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
Primer Premier 5.0
引物设计
限制性内切酶位点分析
DNA基元(motif)查找
同源性分析
Oligo6.69

四、测序图比对、拼接与虚拟克隆(in silico cloning)
常用本地软件：Clone manager、Vector NTI、DNAstar和ds-Gene等
在线工具：BLAST等
常用序列拼接软件
-DNAstar 的SeqMan模块
-VectorNTI程序的Contig Express模块
-Sequencher
导入后可以双击查看和编辑各个测序结果

选择序列，根据实际情况调整序列末端

选择序列拼接

双击查看结果

输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧。

输出结果

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