解靶基因序列检索以及常用引物设计原则是什么？

引物设计的原则是：

1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

2、引物长度一般在15-30碱基之间。

3、引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。

4、引物3′端要避开密码子的第3位。

5、引物3′端不能选择A，最好选择T。

6、碱基要随机分布。

7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。

8、引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。

9、引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

10、扩增产物的单链不能形成二级结构。

11、引物应具有特异性。

针对靶基因序列检测的方法包括荧光定量PCR法、测序法、质谱法、基因芯片法、酶切法

引物设计原则：

1、首先引物与模板的序列要紧密互补。 2、其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。 3、再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应即错配。 4、引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。

靶基因序列检索首先需要知道标准基因号或者基因序列，通过NCBI等数据库检索或者BLAST.

引物设计原则：

①引物长度一般为15-27 bp，最适为18-22 bp（注意此处所指的长度是结合到模板的长度，不包括5'端加修饰后的长度），过长会导致延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。上下游引物长度差不超过4 bp，Tm差不超过2℃。  

②引物序列在模板其他位置应当没有相似性较高的序列，尤其是3'端，否则容易导致错配。引物3'端避免出现3个以上的连续碱基如GGG或CCC。

③引物3'端的末位碱基对Taq酶合成效率有较大影响，末位碱基为A的错配率明显高于其他碱基，应当避免在引物的3'端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5'端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

④引物序列的GC含量一般为40-60%。GC含量过低，则AT含量高，与模板结合能力低；GC含量过高，容易产生二级结构，也不利于结合模板。上下游引物的GC含量不能相差太大。  

⑤引物Tm值范围为55-65℃。Tm值与PCR反应的退火温度相关，退火温度高，引物结合到模板的能力就差（但特异性好）；退火温度低，引物结合到模板的能力就强（但特异性差，非特异性产物多）。