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        如何从自己筛到的菌中获取一种酶的基因序列?

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        华飒飒儿

        目前筛到一种菌,但该菌无全基因组厕所,想获得该菌中的一种酶的基因序列?设计简并引物具体该怎么设计啊?我设计了几次发现并没有p出来我的目的基因?哪位大神可以帮帮忙,马上研三了,卡在这一步半年不止,真的不知道咋办了,实验室的师兄师姐没搞过简并引物,也不太懂。

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        3 个回答

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        先把菌裂解,获取基因序列,然后用已知引物进行配对

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        有直接提取和人工合成法,后者又包括利用逆转录法和化学合成法2种.将目的基因与运载体结合时,必须使用相同的限制性内切酶 处理目的基因和运载体,然后DNA连接酶进行重组.基因工程中常用的运载体有质粒、动植物病毒、噬菌体

        等,其中质粒是最常用运载体.作为运载体通常要有标记基因,便于对目的基因是否导入进行筛选。


        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        获取目的基因序列的方法有很多种,以下是一些常用的方法:

        PCR扩增:根据该酶的保守区域设计特异性引物进行PCR扩增。如果目的基因序列中含有较多的变异,可以考虑设计简并引物,但是需要根据该酶的序列进行合理设计,尽可能避免引物间的交叉杂交。在PCR扩增过程中,需要根据反应体系的优化来调节扩增条件,如引物浓度、模板DNA浓度、反应缓冲液体系、退火温度和时间等。扩增出的产物可以通过PCR产物克隆测序来验证其准确性。

        基于同源克隆:在已知酶的同源物种中,通过PCR扩增同源基因并进行序列比对,找到保守区域,再设计特异性引物进行PCR扩增。

        基于转录组或基因组数据:如果该菌的转录组或基因组已经被测序,可以在数据库中搜索相关信息,找到目的基因序列并设计特异性引物进行PCR扩增。

        对于设计简并引物而言,需要考虑以下几点:

        碱基组合:简并引物的碱基组合需要根据该酶的序列特点进行设计。可以根据AT、GC含量进行合理的组合。比如,可以在引物中加入“N”表示任意一种碱基,以增加引物与模板的匹配度。

        引物长度:简并引物的长度需要合理设计,太短则可能存在非特异性扩增的可能,太长则可能存在引物间的二次结构或杂交,影响PCR反应。

        引物位置:简并引物的位置需要在保守区域内进行设计,以保证特异性。需要考虑引物间的距离和碱基组合的优化,以提高引物特异性和PCR反应效率。

        引物浓度:简并引物的浓度需要优化,以保证扩增效率和特异性。


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