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        酵母菌落PCR方法

        互联网

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        问:很郁闷,最近在做电转毕赤酵母,但是转化完了没有合适的筛选方法,如果提基因组的话费时费钱,而且由于我这个电转的几率十分低,也就有1%-10%,所以想用菌落PCR方法筛选,但酵母菌破壁很困难,如果处理不好的话基因组释放不出来,就没有阳性结果了。

        查了一些资料说用反复冻融法,是不是直接挑单菌落就行了呢?还有说用蜗牛酶帮助消化的,这个我倒不是很清楚,所以请各位大虾们帮帮忙,现在实在是被这个伤透脑筋了!

        求助十万火急!!!!!!!

        答:蜗牛酶提取DNA以后作PCR效果很稳定

        酵母DNA的提取

        1、x新鲜的菌体中加入150ul(200ul)bufferiI25(30)ul蜗牛酶(30mg/ml),37度,10Min(可以30min水浴,中间隔5分钟,振荡一次,避免细胞沉到管底。

          2、离心10000rmp,10min,去上清,沉淀中加入bufferII250ul

          3、加入25ul,10%SDS。65度,30min水浴。

          4、加入25ul 5mol/lKAC,冰浴60分钟(4度冰箱放置就可以)

          5、12000rmp,15min,取上清,在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇,混匀放置-20度一小时(可过夜,取出后不要振荡,直接离心)

          6、12000rmp,15min,弃上清。

          7、150ul,bufferIII溶液沉淀,12000rmp,15min

          8、将上清溶液转到干净的离心管中,加入6ul(10ug/ul),ran酶,37度,30min

          9、加入等体积异丙醇,4度静止10min,10000rmp,5min,溶于50ulbufferIII中

          10、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提

          11、bufferI:0.9mol/l 山梨醇,0.1mol/l EDTA

          12、bufferII:50mmol/l Tris,20mmol/l EDTA

          13、bufferIII:10mmol/l tris,1mol/l EDTA

          14、筛选AD/BD可以直接使用抗生素筛选的方法

        酵母菌落PCR

          1、酵母质粒和基因组DNAPCR模版的制备

          取对数生长期酵母菌株1.5ml,13000r/min,离心15s,去上清,双蒸水洗涤一次,13000r/min 离心15s,沉淀悬浮于200ulTE缓冲液中,在沸水上煮1-10min,冰浴10min,13000r/min,离心5min,将上清液储存于-20度取1ul用于PCR

          2、从平板上调取长势良好的菌落少许,悬浮于含20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中(离心管中央预先用注射器针头扎一个小孔,放置盖子因受热膨胀)水浴煮沸0.2.5.10min

          3、利用微波炉快速制备酵母治理以及菌落取直径大于3mm的酵母干菌落,至于EP管中盖上盖子,在微波炉中加热,加入30ulTE振荡,13000r/min,离心2-5min,上清储存浴-20度,取1ul来作PCR

        真菌DNA的提取方法改良

          1、酵母活化后加入YEPD培养基,25-28度培养16-24小时,收集菌体

          2、取少许新鲜的菌体,加入0.6ml缓冲液I(0.9mol/l 山梨醇,0.1mol/l EDTA)1ml。0.1ml蜗牛酶(30mg/ml),37度温浴60min

          3、3000r/min离心10s,去上清,沉淀加入加入bufferII150mmol/l Tris,20mmol/l EDTA 1ml 10%SDS0.1ml65度,30min水浴。

          4、加入0.3ml ,5mol/lKAC冰浴60分钟

          5、10000rmp,15min,取上清,在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇,混匀放置-20度一小时(可过夜,取出后不要振荡,直接离心)在5000-6000r/min离心15s  

          6、沉淀用0.6ml缓冲液III10mmol/l tris,1mol/l EDTA溶解1000r/min,离心15min

          7、上清液转移一个干净的离心管中,加入6ul10ug/ul),ran酶,37度,30min

          8、加入等体积异丙醇,4度静止10min,10000rmp,5min,溶于50ulbufferIII中

          9、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提

        后续试验思路

          1、提取酵母DNA

          2、作PCR

          3、筛库的引物(上CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC
                 下:GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT
          因为这个引物的TM值很高,所以必须使用二次PCR
          94度,3min,95度,20miao,68度3min,68度7min,15度15min
          修改程序94度,3min,95度,25miao,50度25miao,72度1min30s,72度5min

          4、利用T和B酶切(65度酶切)
          Taq I(AGCT)
          1undefinedTaq I Basal buffer
          0.1%bsa
          PCR产物
          灭菌水
          酶
          BsuRI(GGCC)
          R buffer
          模版
          灭菌水
          酶

          5、分出不同的片断

          6、将DNA转到大肠杆菌中,然后提取质粒,测序或是使用抗生素筛选AMP,得到AD,kana得到BD

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