• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        利用PCR分析酵母菌落

        相关实验:利用 PCR 分析酵母菌落

        最新修订时间:

        原理

        用 PCR 分析酵母菌落时,无需纯化 DNA。本方案以单个酵母菌落的粗裂解液作为 PCR 扩增的模板,来确定酵母中是否携带目的 DNA 序列。 

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        10X 菌落 PCR 缓冲液

        dNTP 溶液(10 mmol/L), 含有 4 种 dNTP ( pH 8.0,PCR 级)

        MgCl2 ( 25 mmol/L)

        2. 酶及其缓冲液

        Taq DNA 聚合酶

        3. 凝胶

        琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶

        4. 核酸和寡核苷酸

        寡核苷酸引物

        DNA 标准参照物

        5. 专用设备

        微量离心管(0.5 ml)

        储存有所需 PCR 方案的程控式 PCR 仪

        6. 载体和酵母菌株

        携带有目的 YAC 重组子的酵母菌株

        二、方法

        1. 在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管里,依次序加入下列物质:10X 菌落 PCR 缓冲液 2 ul,25 mmol/L MgCl2 1.2 ul,10 mmol/L dNTPs 0.4 ul,寡核苷酸引物 每个引物浓度为 10 pmol,Taq 聚合酶 5 单位(0.2 ul),H2O 加至总体系为 20 ul。

        2. 用一个黄色的一次性移液器吸头,吸取少量酵母菌落 ( 0.10~0.25 ul ),加入反应体系。

        3. 将 PCR 管放进 PCR 仪内。按下面程序进行 PCR 反应。

        利用PCR分析酵母菌落

        4. 用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 PCR 产物。电泳应采用适宜大小的标准参照物。

        注意事项

        1.  设计引物很关键。一般如果是定向克隆,用载体上的通用引物即可。如果是非定向克隆(如单酶切或平末端连接),一条引物用载体,一条引物用目的基因上的,这样就可以比较方便的鉴定了,而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳,同时挑取的菌体不宜太多,否则会有非特异性扩增。


        2.  使用的引物浓度不能太高,浓度过高会导致非特异性扩增,反应的循环数也不能太多,一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题,有的GC含量很低,有的又很高,导致菌落PCR不容易扩增出目的条带,在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限,每一循环降0.2度左右。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序