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        Akt的WB问题

        丁香园论坛

        10445


        最近做Akt的WB遇到了问题:
        我用的是CST的Akt抗体以及pAkt抗体,染小鼠组织(肝,肾,脾,肺,脑等)。
        5%BSA(TBST稀释)4度封闭过夜
        之后一抗是5%脱脂牛奶稀释,1:500,过夜,二抗1:2000稀释,2-3h
        染出来的片子很脏,而且Akt勉强可以见到,但是pAkt没染出来条带
        提组织用的是RIPA(每100mg用500ul),加了PMSF以及NaF,冰上操作,裂解1h,4度离心30min,取上清。
        各位砖家有没有用CST抗体的,指点一二,小弟万分感谢!
        CST的抗体用的多去了
        总体来说akt的抗体还行
        pakt用过两个效果不是特别好

        蛋白提取的时候没有加其它的磷酸酶抑制剂?
        一抗与二抗稀释的时候用5% BSA-TBST
        一抗1:500是不是有点高了?
        怎么没有试试1:1000?1:2000?
        另外二抗稀释度需要调整,可以减低背景
        ECL用那个公司的?
        楼上正解。

        个人建议:
        1)裂解RIPA中加入磷酸化酶抑制剂;
        2)CST的p-AKT刚好用过,建议用1:1000,二抗1:5000;
        3)裂解时每15分钟混匀一次,裂解1h;
        4)注意发光液有无过期;如有条件,可参考我发过的一个关于现配发光液的帖子;
        5)我的经验是,上样30-50g蛋白时,曝光时间p-AKT需要15分钟(参照Actin 3秒钟);
        6)可考虑根据说明书取阳性对照样本上样,我们是用小鼠肝癌组织蛋白。

        祝好运!
        谢谢各位!
        磷酸酶抑制剂只加了NaF,没加别的。
        ECL用的是Pierce的,应该没有过期,因为染别的没问题
        楼上说的上样应该是30-50ug吧~~~
        我再根据你们说的试试看,有结果回来汇报~~~
        最好是按照CST的protocol来做,比如封闭用5%牛奶(而非5%BSA,尤其是对pAKT 而言,效果更好)in TBST 室温一个小时,一抗稀释在5%BSA in TBST 中(而非5%脱脂牛奶)4度过夜,这样我相信背景会降低,提高信噪比。
        ylhuang0502 wrote:
        最好是按照CST的protocol来做,比如封闭用5%牛奶(而非5%BSA,尤其是对pAKT 而言,效果更好)in TBST 室温一个小时,一抗稀释在5%BSA in TBST 中(而非5%脱脂牛奶)4度过夜,这样我相信背景会降低,提高信噪比。


        补充一些,

        理论上, 用WB测蛋白的磷酸化的时候,常规是BSA比牛奶更好. 因为牛奶中含有casein, 会非特异性的和测磷酸化的抗体结合,导致背景着色提高.AKT的磷酸化,我自己也用过BSA 也用过脱脂奶粉.感觉没多大区别.

        磷酸化如果测不出来的时候

        1. 可能是这个组织或细胞本身的磷酸化很低. 但是你用的那几个脏器,比如肝肺 都能测出来的.像前面几位战友说的那样,可以考虑加大上样量

        2. 是否WB的条件不好? 可以跑其他蛋白的WB看看,如果其他蛋白质都跑出来的很好的话, 可以考虑换个抗体试一试,,但是话说回来,cell signaling的p-AKT 很好的,我也用了好几年.ser473和T308都不错的.

        3. 条带弱的话,可以用 can get sinal 去提高抗体的敏感度.

        BTW, 我自己跑p-akt的时候, 1抗是1:1500 2抗是 1:20000

        good luck
        我看好多文章都是通过提取组织来做wb 而我要做的是细胞 是否好做?因为时间紧所以想随便问一下 Akt 及p-AKT的wb是否好做?
        二抗孵育时间太长,会把一抗洗掉。应缩减至1小时。
        我的PAKT信号总是很强。有时不得不只上样1ug,一抗和二抗孵育时间有时只能缩减至10分钟。

        http://www.dxy.cn/bbs/thread/21961528#21961528

        http://www.dxy.cn/bbs/topic/24176732

        PMID: 23195959

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        师兄微信号:shixiongcoming

        Akt的WB问题

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