• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        一些有关p-ERK WB的问题

        丁香园论坛

        7102
        因为最近作磷酸化的ERK的western ,我用的是Hela 229 细胞,但是比较郁闷的是,这个细胞为什么阳性对照组和没有任何处理的一组都有磷酸化的ERK?是我细胞坏了还是本来这个细胞就是这样?我用Hela 细胞试了下,对照组也有一点,但是明显比阳性对照组弱,293细胞也是。但是就是229细胞没有任何区别,我很郁闷,试了好几次都是这样,因为前期大量实验都是在229细胞上做的,所以不能选其他细胞了。。
        请求有经验的大哥大姐指教。。。。不胜感激。。。
        蛋白定量后上样量一致吗?
        内参做了没有?
        一你可以搜索本版内有关p-ERK WB的相关帖子,相信你会找到不少可以提高阳性率的注意事项;

        二是我没有用过hela系细胞株。但如果你找得到SW480(结肠癌)细胞株,是一个非常好的阳性对照,一秒钟曝光,条带强得一塌糊涂.......

        祝好运!
        不知道你是如何处理细胞的,也不知道你所谓的阳性对照是什么意思。
        一般来说,检测磷酸化蛋白时需要对细胞进行去血清处理,消除细胞的本底磷酸化水平。你所用的229可能本身的ERK磷酸化就很高,因此你处理后不一定能看出效果来,而293和因为正常情况下ERK磷酸化水平不高,自然处理后磷酸化就变化较明显。

        建议:先用无血清培养基培养细胞过夜,然后进行你所需要的处理,注意处理时仍不能用血清,否则出来的信号可能只是由血清所激活的。
        fangweibin119 wrote:
        蛋白定量后上样量一致吗?
        内参做了没有?

        内参做了,都一样的。
        thinku_lo wrote:
        一你可以搜索本版内有关p-ERK WB的相关帖子,相信你会找到不少可以提高阳性率的注意事项;

        二是我没有用过hela系细胞株。但如果你找得到SW480(结肠癌)细胞株,是一个非常好的阳性对照,一秒钟曝光,条带强得一塌糊涂.......

        祝好运!

        恩,谢谢,可是因为我们前期试验都是在229中作的,所以我就希望能在229中能做出来这个。
        bigrabbit wrote:
        不知道你是如何处理细胞的,也不知道你所谓的阳性对照是什么意思。
        一般来说,检测磷酸化蛋白时需要对细胞进行去血清处理,消除细胞的本底磷酸化水平。你所用的229可能本身的ERK磷酸化就很高,因此你处理后不一定能看出效果来,而293和因为正常情况下ERK磷酸化水平不高,自然处理后磷酸化就变化较明显。

        建议:先用无血清培养基培养细胞过夜,然后进行你所需要的处理,注意处理时仍不能用血清,否则出来的信号可能只是由血清所激活的。

        哦~~阳性对照就是加了ERK通路的激活剂,然后不处理的CONTROL组就没有任何处理,就是平常那样加了培养基养着的,也没有像你说的加无血清培养基先处理。
        bigrabbit wrote:
        不知道你是如何处理细胞的,也不知道你所谓的阳性对照是什么意思。
        一般来说,检测磷酸化蛋白时需要对细胞进行去血清处理,消除细胞的本底磷酸化水平。你所用的229可能本身的ERK磷酸化就很高,因此你处理后不一定能看出效果来,而293和因为正常情况下ERK磷酸化水平不高,自然处理后磷酸化就变化较明显。

        建议:先用无血清培养基培养细胞过夜,然后进行你所需要的处理,注意处理时仍不能用血清,否则出来的信号可能只是由血清所激活的。

        那我想问一下,如果我要培养我的细胞24小时之后才能收,那我需要整个过程中都要保持细胞用无血清的培养基吗?那细胞会不会发生凋亡?
        磷酸化与去过程一般来说是一个非常迅速的过程,通常在几分钟至几十分钟内就完成了。可能是我孤陋寡闻了,我觉得检测时间能由几分钟至2-3小时已经足够了。当然如果你的实验一定要观察至24小时,无血清饥饿就不合适了。

        如果你的目的是要看一下细胞对刺激的反应,建议你先观察一下短时间的反应,比如无血清处理后,收集5min,15min,30min,60min,2hr,4hr的蛋白,这是文献中常用的方法,我没有找到有文献报道需观察24小时的。
        bigrabbit wrote:
        磷酸化与去过程一般来说是一个非常迅速的过程,通常在几分钟至几十分钟内就完成了。可能是我孤陋寡闻了,我觉得检测时间能由几分钟至2-3小时已经足够了。当然如果你的实验一定要观察至24小时,无血清饥饿就不合适了。

        如果你的目的是要看一下细胞对刺激的反应,建议你先观察一下短时间的反应,比如无血清处理后,收集5min,15min,30min,60min,2hr,4hr的蛋白,这是文献中常用的方法,我没有找到有文献报道需观察24小时的。

        哦,谢谢你了,其实我处理24小时是用病毒感染的不同时间。。

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

        一些有关p-ERK WB的问题

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序