一些有关p-ERK WB的问题
丁香园论坛
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因为最近作磷酸化的ERK的western ,我用的是Hela 229 细胞，但是比较郁闷的是，这个细胞为什么阳性对照组和没有任何处理的一组都有磷酸化的ERK？是我细胞坏了还是本来这个细胞就是这样？我用Hela 细胞试了下，对照组也有一点，但是明显比阳性对照组弱，293细胞也是。但是就是229细胞没有任何区别，我很郁闷，试了好几次都是这样，因为前期大量实验都是在229细胞上做的，所以不能选其他细胞了。。
请求有经验的大哥大姐指教。。。。不胜感激。。。
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蛋白定量后上样量一致吗？
内参做了没有？
内参做了没有？
一你可以搜索本版内有关p-ERK WB的相关帖子，相信你会找到不少可以提高阳性率的注意事项；
二是我没有用过hela系细胞株。但如果你找得到SW480(结肠癌)细胞株，是一个非常好的阳性对照，一秒钟曝光，条带强得一塌糊涂.......
祝好运！
二是我没有用过hela系细胞株。但如果你找得到SW480(结肠癌)细胞株，是一个非常好的阳性对照，一秒钟曝光，条带强得一塌糊涂.......
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不知道你是如何处理细胞的，也不知道你所谓的阳性对照是什么意思。
一般来说，检测磷酸化蛋白时需要对细胞进行去血清处理，消除细胞的本底磷酸化水平。你所用的229可能本身的ERK磷酸化就很高，因此你处理后不一定能看出效果来，而293和因为正常情况下ERK磷酸化水平不高，自然处理后磷酸化就变化较明显。
建议：先用无血清培养基培养细胞过夜，然后进行你所需要的处理，注意处理时仍不能用血清，否则出来的信号可能只是由血清所激活的。
一般来说，检测磷酸化蛋白时需要对细胞进行去血清处理，消除细胞的本底磷酸化水平。你所用的229可能本身的ERK磷酸化就很高，因此你处理后不一定能看出效果来，而293和因为正常情况下ERK磷酸化水平不高，自然处理后磷酸化就变化较明显。
建议：先用无血清培养基培养细胞过夜，然后进行你所需要的处理，注意处理时仍不能用血清，否则出来的信号可能只是由血清所激活的。
fangweibin119 wrote:
蛋白定量后上样量一致吗？
内参做了没有？
内参做了，都一样的。
thinku_lo wrote:
一你可以搜索本版内有关p-ERK WB的相关帖子，相信你会找到不少可以提高阳性率的注意事项；
二是我没有用过hela系细胞株。但如果你找得到SW480(结肠癌)细胞株，是一个非常好的阳性对照，一秒钟曝光，条带强得一塌糊涂.......
祝好运！
恩，谢谢，可是因为我们前期试验都是在229中作的，所以我就希望能在229中能做出来这个。
bigrabbit wrote:
不知道你是如何处理细胞的，也不知道你所谓的阳性对照是什么意思。
一般来说，检测磷酸化蛋白时需要对细胞进行去血清处理，消除细胞的本底磷酸化水平。你所用的229可能本身的ERK磷酸化就很高，因此你处理后不一定能看出效果来，而293和因为正常情况下ERK磷酸化水平不高，自然处理后磷酸化就变化较明显。
建议：先用无血清培养基培养细胞过夜，然后进行你所需要的处理，注意处理时仍不能用血清，否则出来的信号可能只是由血清所激活的。
哦~~阳性对照就是加了ERK通路的激活剂，然后不处理的CONTROL组就没有任何处理，就是平常那样加了培养基养着的，也没有像你说的加无血清培养基先处理。
bigrabbit wrote:
不知道你是如何处理细胞的，也不知道你所谓的阳性对照是什么意思。
一般来说，检测磷酸化蛋白时需要对细胞进行去血清处理，消除细胞的本底磷酸化水平。你所用的229可能本身的ERK磷酸化就很高，因此你处理后不一定能看出效果来，而293和因为正常情况下ERK磷酸化水平不高，自然处理后磷酸化就变化较明显。
建议：先用无血清培养基培养细胞过夜，然后进行你所需要的处理，注意处理时仍不能用血清，否则出来的信号可能只是由血清所激活的。
那我想问一下，如果我要培养我的细胞24小时之后才能收，那我需要整个过程中都要保持细胞用无血清的培养基吗？那细胞会不会发生凋亡？
磷酸化与去过程一般来说是一个非常迅速的过程，通常在几分钟至几十分钟内就完成了。可能是我孤陋寡闻了，我觉得检测时间能由几分钟至2-3小时已经足够了。当然如果你的实验一定要观察至24小时，无血清饥饿就不合适了。
如果你的目的是要看一下细胞对刺激的反应，建议你先观察一下短时间的反应，比如无血清处理后，收集5min，15min，30min，60min，2hr，4hr的蛋白，这是文献中常用的方法，我没有找到有文献报道需观察24小时的。
如果你的目的是要看一下细胞对刺激的反应，建议你先观察一下短时间的反应，比如无血清处理后，收集5min，15min，30min，60min，2hr，4hr的蛋白，这是文献中常用的方法，我没有找到有文献报道需观察24小时的。
bigrabbit wrote:
磷酸化与去过程一般来说是一个非常迅速的过程，通常在几分钟至几十分钟内就完成了。可能是我孤陋寡闻了，我觉得检测时间能由几分钟至2-3小时已经足够了。当然如果你的实验一定要观察至24小时，无血清饥饿就不合适了。
如果你的目的是要看一下细胞对刺激的反应，建议你先观察一下短时间的反应，比如无血清处理后，收集5min，15min，30min，60min，2hr，4hr的蛋白，这是文献中常用的方法，我没有找到有文献报道需观察24小时的。
哦，谢谢你了，其实我处理24小时是用病毒感染的不同时间。。
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