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        克隆做了半年没有转化子?

        丁香园

        2309
        我做不出来克隆的时间长达半年,期间克隆实验方面许多问题都遇到过,现在总结主要的一些问题和大家交流,希望大家以后不要犯我一样的错,少走弯路。

        1. 感受态要验证

        感受态细菌本身有质粒污染,这个问题困扰了我三个月,一直到最近才找到原因,我这里犯了最大的错是没有做过感受态检测。

        也许大家奇怪为什么在三个月内的时间里没有怀疑到感受态,不用奇怪,因为感受态「表现的太正常了」,每次涂板都长菌斑,每板 20-30 左右,很正常。

        我一个同学用这样的感受态做自己的克隆没有任何问题,得到了自己的克隆。我用这个感受态做 T 载体转化也没有问题,可以得到阳性克隆,因此很难让我想到是感受态的问题。

        2. 酶切产物电泳后回收

        胶回收试剂盒,我用得是 promega 的,记住酶切产物一定要电泳之后回收,如果直接把酶切产物回收会造成大量的假阳性。这个问题困扰了我半个月。

        3. 引物设计要无误

        我做的克隆是把大、小两个目的片段头尾相连到载体中,大小片段之间有一个共同的酶切位点,大小片段之间也有一段共同序列。由于引物设计错误,我人为地引入了一个插入突变,导致三个月的实验活白干。

        4. 请少改造质粒

        在有经费的条件下,尽量避免改造质粒。我改造过质粒,想把质粒上的启动子删掉,中间过程很麻烦,最后也没有改造成功,因为改造后的质粒出现了一个莫名奇妙的变异——65bp 的缺失突变,这个工作给我添了很多麻烦,细节就不说了。

        5. 测序要找靠谱公司

        测序长片段,比如 4k 左右或者以上请找一家好的测序公司,否则给克隆造成很大的影响,测序时间长不说,还有测错、测不出来等毛病。

        6. 养成实验好习惯

        养成良好的实验习惯,开始接触克隆时都要做好对照,即做酶切时要做酶切对照,做转化是要做感受态对照和载体空载对照。

        第一次做克隆时,要确定所有用到的材料都是好使的,其中最关键的是内切酶、buffer、载体、感受态大肠杆菌(常用 DH5)和连接酶。

        克隆材料没有问题的话,就要学习做克隆的相关方法,有大量的经验心得之类的帖子可以在丁香通网站找到。其中比较重要的是载体和连接片段的比例和大小。

        很多有经验的人都说菌落 PCR 假阳性太高,这个问题我遇到过,当我把引物设计很好的时侯就避免了假阳性的出现。所以不要对菌落 PCR 存在偏见,关键在于引物的设计。

        作者:dudiaojiangxue

        题图来源:网络

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