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        枯草芽孢杆菌的电转化没有转化子,请指教!

        丁香园论坛

        5856
        我以前做的实验都是通过感受态的转化方法来转化枯草芽孢杆菌的。
        但是枯草芽孢杆菌的感受态转化效率比较低。
        最近我采用电转化的方法,但是遇到了一个问题:

        就是每次电击完毕后,加入复苏缓冲液37度复苏2h后,发现原来还混混的转化液竟然变得澄清了!涂布后一个转化子都没有!不知道是怎么回事?

        还有:垂悬菌体必须要温柔吗?我挺用力的,但不至于一个转化子都没有吧?
        质粒样品里面的RNA很多有没有影响啊?我的质粒RNA蛮多的。

        质粒加多了是不是也会严重影响电转化效率啊?

        希望大家给看看,问题出在哪里?谢谢各位!!!

        附:
        枯草芽孢杆菌电转化方案
        1 感受态细胞的制备
        1.1 从新鲜培养的平板上接种一单菌落至3 ml B2液体培养基中,试管(17×100 mm)。
        1.2 250 rpm,37℃培养过夜(16 h)。
        1.3 接种1.5 ml过夜培养的种子至150 ml(装于1L的三角瓶中)新鲜的B2培养基中,200 rpm,37℃培养,至菌数达到~1×108 cells/ml。
        1.4 将菌液冰水浴15 min,然后转移至250 ml的离心杯中,12,000 g,5 min,4℃离心收集菌体。
        1.5 吸去上清,菌体保持在冰水浴中。
        1.6 用250 ml冰冷的无菌水重新垂悬菌体,然后12,000 g,5 min,4℃离心去上清。应该用250 ml的无菌水洗涤2次以上。
        1.7 将洗涤后的菌体垂悬于25 ml冰冷的10%的甘油中,转移至30 ml的离心管中,12,000 g,5 min,4℃离心去上清。
        1.8 重新将菌体沉淀垂悬于2 ml 10%的甘油之中,细胞浓度~1×1010 cells/ml。
        1.9 将感受态细胞分装于1.5 ml的离心管中,每份250 ul,超低温速冻之后,于-70℃保藏。可以保持几个月不失效。
        2 电转化
        2.1 在一个1.5 ml的离心管中加入DNA样品(5 ng~2 ug,~3 ul)。
        2.2 室温下几分钟的时间融化感受态细胞,然后在加好DNA样品的管子中各加入50 ul感受态细胞,抽吸几次混匀。
        2.3 室温下温育30 min。
        2.4 设置仪器参数。
        2.5 将菌体转移到0.2 cm狭缝的电转化杯中,轻弹几下杯子让样品沉到底部。装好杯子。
        2.6 电击一次。
        2.7 电击完毕取出杯子并立即加入1 ml SMMP溶液(含有亚浓度的相应抗生素)。温和地将其转移至试管(17×100 mm)中,37℃,250 rpm,复苏 1h。
        2.8 查看和记录电击参数,时间常数应该在2.5 ms左右,记录场强(kV/cm)。
        2.9 涂布相应的LB抗性平板,37℃培养36~48 h。
        3 溶液和试剂
        3.1 B2培养基:水解酪蛋白10 g,酵母粉25 g,葡萄糖5 g,NaCl 5 g,K2HPO4 1 g,加900 ml去离子水,调pH值到7.5,定容至1 l,灭菌。
        3.2 SMMP溶液:55 ml 2×SMM,40 ml 4×PAB,5 ml 10%(w/v)BSA,调pH值到7.0,过滤除菌。
        3.3 2×SMM:25 ml 0.2 M的马来酸(顺丁烯二酸)钠盐,40 ml 0.1 N NaOH,调pH值到6.5,加入5 ml 1 M MgCl2,42.7 g 蔗糖,溶解定容至125 ml,过滤除菌。
        3.4 4×PAB:牛肉膏6 g,酵母膏6 g,蛋白胨20 g,葡萄糖4 g,NaCl 14 g,K2HPO4 14.72 g,KH2PO4 5.28 g。
        3.5 0.2 M马来酸钠盐:11.6 g马来酸酐或者13.7 g马来酸,4 g NaOH,定容至500 ml,灭菌。
        3.6 LB培养基:酵母粉5 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g,定容至1000ml,pH为7.2~7.5。
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