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PCR 的花式死法

丁香园

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有人问:这个 PCR 都是怎么失败的?

拿错枪、上错样、弄错顺序、上机后忘启动 PCR 仪,总之你能想到的步骤总有人会出错。

但是在实验室摸爬滚打了一段时间,熟读 protocol,与 PCR 进行过多次正面交锋,结果仍然失败,这大概是高阶选手只犯高级错误了……

对于正常操作后,PCR 结果依然存在的问题,比如无扩增产物或扩增效率低、 出现非特异性扩增或 smear 带、扩增平坡等,你可能需要调整实验的各种步骤和条件。小编特别整理了以下解决方法,希望可以帮到大家:

问题 1:无扩增产物或扩增效率低

解决方法:

1. 不要使用包含 dUTP 和 dITP 的引物;

2. 样本浓度低,增加模板量;

3. 可能模板 DNA 降解,使用高质量的模板;

4. 增加延伸时间;

5. 增加循环数;

6. 优化退火温度;

7. 优化酶用量。

问题 2:出现非特异性扩增或 smear 带

解决方法:

1. 减少酶用量;

2. 缩短延伸时间;

3. 减少循环数;

4. 降低引物浓度。

问题 3:扩增平坡

解决方法:

1. 检查引物和 dNTP 等是否消耗完毕和 Taq 酶是否失活;

2. 底物过剩导致,可考虑延长延伸时间或添加 Taq 酶;

3. 非特异性扩增产物的竞争导致,需提高反应特异性;

4. 退火时产物的单链自己缔合导致,当产物浓度到达 10 pmol/100 μL 时即可发生此现象,需进行产物浓度稀释。

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