PCR 的花式死法
丁香园
有人问:这个 PCR 都是怎么失败的?
拿错枪、上错样、弄错顺序、上机后忘启动 PCR 仪,总之你能想到的步骤总有人会出错。
但是在实验室摸爬滚打了一段时间,熟读 protocol,与 PCR 进行过多次正面交锋,结果仍然失败,这大概是高阶选手只犯高级错误了……
对于正常操作后,PCR 结果依然存在的问题,比如无扩增产物或扩增效率低、 出现非特异性扩增或 smear 带、扩增平坡等,你可能需要调整实验的各种步骤和条件。小编特别整理了以下解决方法,希望可以帮到大家:
问题 1:无扩增产物或扩增效率低
解决方法:
1. 不要使用包含 dUTP 和 dITP 的引物;
2. 样本浓度低,增加模板量;
3. 可能模板 DNA 降解,使用高质量的模板;
4. 增加延伸时间;
5. 增加循环数;
6. 优化退火温度;
7. 优化酶用量。
问题 2:出现非特异性扩增或 smear 带
解决方法:
1. 减少酶用量;
2. 缩短延伸时间;
3. 减少循环数;
4. 降低引物浓度。
问题 3:扩增平坡
解决方法:
1. 检查引物和 dNTP 等是否消耗完毕和 Taq 酶是否失活;
2. 底物过剩导致,可考虑延长延伸时间或添加 Taq 酶;
3. 非特异性扩增产物的竞争导致,需提高反应特异性;
4. 退火时产物的单链自己缔合导致,当产物浓度到达 10 pmol/100 μL 时即可发生此现象,需进行产物浓度稀释。