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        PCR

        最新修订时间:

        原理

        PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步,经过一定的循环,介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。 

        材料与仪器

        步骤

        1.  调整模板浓度至10 ng/ml

        2.  按下列体系配制反应混合液,混匀,加一滴矿物油,离心5秒
        Template DNA        (20 ng)2 
        buffer              2.0 ´10 μl
        MgCl2(25 mM)        1.5 μl
        lmPrimer F (10 mM)        0.2 μl
        Primer R (10 mM)        0.2 μl
        lmdNTPs(2 mM)        2.0 μl
        Taq(5 U/μl)  2.0 μl
        Add ddH2O  to    20 μl

        3.  PCR反应循环条件设置:
        95 ℃                     1 cycle
        94 ℃   55 ℃  1'   72 ℃  1'30"   35 cycles
        72 ℃                    1 cycle
        4 ℃                       forever

        溴酚蓝,混匀,短暂离心,取15 ml
         
        4.  检测:加2 ml反应产物点样电泳;

        5.  在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳;EB染色,紫外观察。

        注意事项

        1. PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增,应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染,这是造成假阳性最大的可能。


        2. DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上,所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理,常规消耗用品用后作一次性处理,避免反复使用造成污染。


        3. PCR在超净台内进行,操作前后紫外灯消毒。超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品;移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器,防止移液器基部污染。


        4. PCR操作应戴手套并勤于更换。


        5. 成套试剂,小量分装,专一保存,防止它用。配制试剂用新器具,用后作一次性处理。


        6. 试剂管用前先瞬时离心(10s),使液体沉于管底,减少污染手套与加样器机会。


        7. 最后加模板DNA(包括在石蜡油后),马上盖好,混匀,瞬时离心(10s),使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染,所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。


        8. 实验设阳性、阴性对照。

        来源:丁香实验

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