抗原设计

免疫金银染色法是利用银显影液，胶体金颗粒起着液化作用，使显影液中的银离子在还原剂（对苯二酚）存在情况下被还原成银原子，在金颗粒周围形成一个“银壳”，由于金颗粒的液化作用，使更多的银离子被还原，“银壳”增大，最后使抗原位置得以放大。【试剂及材料】（1）0．5%胰蛋白酶或胃蛋白酶：用0.05mol/L ...

免疫放射分析技术（用核素标记的抗体检测抗原） 1968年Miles和Hales建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法，为了与放射免疫分析区别，故称免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA）。由于它应用核素标记抗体作为示踪剂，在反应体系中加入过量的抗体，待测抗原（或标准品）与和核素标记抗体进行全量反应，故亦称非竞争性免疫分析法。IRMA与RIA相比较有 ...

放射免疫分析技术(用核素标记的抗原检测抗原)【基本原理】 放射免疫分析技术（radioimmunoassay，RIA）一般采用竞争结合分析技术。其基本原理为放射性标记抗原和被测抗原（或标准品）对有限的特异性抗体发生可逆性的竞争结合反应，最终形成的放射性抗原-抗体复合物量与被测物的含量呈负相关。当抗体的量固定不变时，免疫复合物的形成就受到待测抗原含量的制约。如反应系统中待测Ag含量高时，对A ...

PCR反应体系的三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)&nbs

PCR反应体系的耐热DNA聚合酶 DNA的体外扩增是由许多不同来源的DNA聚合酶完成的。对PCR而言，热稳定DNA聚合酶（如Tag、Vent和pfu）优于热不稳定聚合酶（如T4、T7和Klenow），因为它们更易操作和实现自动化，其中以Taq DNA聚合酶的应用最为广泛。Taq DNA聚合酶的分子量为94kD这种酶不显示任何3，→5，核酸外切酶活性它的最适反应温度在75℃左右对95℃的变温 ...

PCR反应体系的Mg2+的浓度 Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外也影响引物的退火 模板与PCR产物的解链温度产物的特异性引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时酶活力明显降低;过高时酶可催化非特异性扩增。PCR中Mg2+浓度在0.5～2.5mmol/L之间。如果溶液中存在EDTA或在引物贮备液中有其他螯合物或者DNA模板会干扰Mg2+的浓度。因此 ...

PCR常见问题及处置 1、没有扩增产物形成： ①循环温度，特别是解链温度是否确切，注意PCR仪的指示温度是否与实际温度相符； ②引物的组成是否正确，有无二级结构的形成； ③聚合酶活性是否正常； ④反应系统有无蛋白酶或核酸酶的存在，使聚合酶或模板及产物降解，可在95℃以上处理反应系统使其灭活； ⑤某些来源的DNA可能有较难去除的蛋白质成分抑制PCR系统用蛋白 ...

白细胞标本DNA PCR反应模板的制备 方法一 【试剂与配制】蛋白酶K：20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5TE缓冲液（pH7.5 或8.0）PBS（磷酸盐缓冲液）钾缓冲液：50mmol/L KCl10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)，1%laureth12 ，0.5% Tween-20，蛋白酶K（100μg/m ...

固定和包埋的组织标本DNA PCR反应模板的制备 石蜡包埋组织和其他固定组织代表档案标本。由于PCR可以扩增相对于完整的染色体DNA来说较短的DNA片段，而且在一定程度上可接受降解的DNA，所以固定组织适用于分子遗传学研究。这些组织是前瞻和回顾性分子遗传学和感染疾病研究的巨大资源。大部分固定和包埋组织标本经福尔马林固定，分析前样品大多要进行脱蜡和水化，再用蛋白酶消化。 【试剂与配制】（ ...

点杂交膜的制备 当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。通过将PCR 产物固定于尼龙膜和硝酸纤微素膜上，再用标记的探针进行点杂交。点杂交可检测突变DNA的突变类型，而应用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。 方法有二：一是将PCR产物固定至膜上，液相中的探针与其杂交；二是将多种探针固定于同一膜上不同区域，再与液相中的PCR产物杂交，根据阳性位置即可判断产物的类型。1．PCR产物的固定 ...

点杂交的检测 现在大多数的实验室里，常用的标记物为地高辛和生物素，下面主要介绍这两种标记系统的显色方法。1． 地高辛标记探针和PCR引物【试剂与配置】缓冲液Ⅰ：150mmol/L NaCl 100mmol/L Tris-HCl (pH7.5)缓冲液Ⅱ：0.5%阻断剂溶于缓冲液Ⅰ缓冲液Ⅲ：100mmol/L NaCl 100mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，50mmol/ ...

PCR产物的检测点杂交1．寡核苷酸探针杂交 【试剂与配置】 预杂交液：5×SSC，5×Denhadrt 0.5%Triton X-100 2×SSC/0.1%SDS 1×SSC/0.1%SDS 0.1×SSC/0.1%SDS 【操作方法】 (1) 将2×SSC湿润的杂交膜放入50ml试管中，再加入5～10ml预杂交液，盖上盖子； （2）置于杂交炉中，在杂交温度下（比探 ...

免疫PCR(IM-PCR)注意事项 (1)固相载体的选择：主要取决于抗原在固相载体上的吸附程度。如果抗原吸附良好，可以进行IM-PCR。如果抗原吸附不良，则需选用双抗体夹心IM―PCR。另外选用的固相载体要和PCR仪器相匹配。一般用0.5ml的塑料反应管，也可以用微量滴定板。 (2)待检抗原的特异性抗体：这是决定本法特异性和敏感性的关键试剂，使用相应的McAb为宜。将抗体进行生物素 ...

原位PCR的反转录 原位PCR的反转录不同于原位PCR的过程包括两个：即蛋白酶消化后用无RNA酶的DNA酶消化过夜和原位PCR的反转录过程。此处主要介绍这两个过程，其余方法同原位PCR。1．DNA酶消化【试剂与配制】无RNA酶的DNA酶10×缓冲液：35μl 3mol/L NaAc，5μl 1mol/L MgSO4，60μl DEPC水【操作方法】（1）在蛋白酶处理过的玻片上加入1μl ...

竞争PCR作mRNA定量 此种技术的策略是用一种竞争模板与靶序列cDNA同时扩增，使用同样的引物经过PCR扩增之后，能将这些靶cDNA区别开来。竞争模板是一种突变的靶cDNA，它的突变位点为一个新的限制性内切酶位点，这种突变体能够很容易地用PCR定点诱变来得到。也有利用基因组质粒DNA作为竞争模板，在紧靠一小段(10～200bp)内含子序列的两个外显子上选择寡核苷酸引物，按照靶cD ...

不同浓度竟争模板和控制混合液的配制────────────────EP管号 竟争模板gGM浓度 用量(ng/μl)────────────────1 10.0 10μl2 1.0 10μl3 0.8 10μl4

应用PCR扩增T细胞受体基因重排【操作方法】 （1） 引物设计：引物1～11是用于PCR的引物其目的是扩增目的基因和分离特异性探针分别适用于Vδ1-D1-Jδ1重排和Vδ2-Dδ3重排的检测。见表。引物4中用G#取代野生型A产生限制性内切酶Fok1位点。 表 扩增TCR基因重排PCR引物────────────────(1) 5’-GTGTGTATTTGTGGCCTTCA-3’(2 ...

用PCR检测白血病时T细胞受体β链基因重排【操作方法】 （1） 引物设计：已知基因重排分二步进行其结果为：①D/J重排:Dβ1和Jβ6 Jβ7之间重排产生D―N―J融合片段N为随机寡核苷酸；②V/D重排:Vβ和Dβ1―N―Jβ6―Jβ7之间再重排，产生V―N’―D―N―J重排片段。对于D/J重排引物设计于Dβ1和Jβ2互补片段，对于V/D重排则设计一条与Vβ片段互补，另一条与Jβ2片段互 ...

间接原位PCR（原位杂交PCR）与直接原位PCR所不同的是，靶基因在扩增时不进行标记基团的掺入，而是标记一段与扩增片段互补的探针，在扩增结束后，应用此探针进行原位杂交。因此，此处主要介绍原位杂交，其余方法同原位PCR。1．预杂交【试剂与配制】2×SSC50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脱脂奶粉【操作方法】（1）在进行完原位P ...

PCR在淋巴细胞抗原受体研究中的应用 T细胞识别各种抗原，是依靠细胞表面的T细胞受体复合物(TCR)。TCR是由4条多肽链(α.β.γ.δ)组成，每条链由相应的基因编码，其基因是由高变区(V)，多样区(D)，连接区(J)和恒定区(C)组成。由于不同的V―D―J重排，使PCR产生多样性和特异性。经PCR扩增可以检测细胞单克隆基因重排，同样，免疫球蛋白(Ig)重链基因重排是产生抗体多样性和特 ...