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        原位PCR的反转录

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        原位PCR的反转录不同于原位PCR的过程包括两个:即蛋白酶消化后用无RNA酶的DNA酶消化过夜和原位PCR的反转录过程。此处主要介绍这两个过程,其余方法同原位PCR。

        1.DNA酶消化

        【试剂与配制】

        无RNA酶的DNA酶

        10×缓冲液:35μl 3mol/L NaAc,5μl 1mol/L MgSO4,60μl DEPC水

        【操作方法】

        ① 在蛋白酶处理过的玻片上加入1μl 10×缓冲液,1μl无RNA酶的DNA酶(10U/μl),8μl DEPC水;

        ② 用一个灭菌的聚丙烯塑料封条盖住溶液以防蒸发,将载玻片置于37℃的湿盒内;

        ③ 消化过夜,除去封条,用DEPC水洗1min,再用无水乙醇洗,空气干燥。

        2.反转录

        【操作方法】

        ① 在DNA酶消化的切片上,加入下列溶液:2μl 25mmol/L MgCl2,1μl RT缓冲液,1μl 10mmol/L dNTP,1.5μl DEPC水,0.5μl 20μmol/L 3’端引物,0.5μlRNA酶抑制剂,0.5μl反转录酶;

        ② 用一滴指甲油固定封条以防蒸发,将载玻片放入PCR仪的加热板上,盖上矿物油,42℃反应30min;

        ③ 出掉封条,二甲苯洗5min除油,用无水乙醇洗5min,空气干燥;即可进行PCR扩增,方法同上。

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