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        间接原位PCR(原位杂交PCR)

        互联网

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        与直接原位PCR所不同的是,靶基因在扩增时不进行标记基团的掺入,而是标记一段与扩增片段互补的探针,在扩增结束后,应用此探针进行原位杂交。因此,此处主要介绍原位杂交,其余方法同原位PCR。

        一、预杂交

        1. 试剂与配制

        2×SSC

        50%去离子甲酰胺:用4×SSC配制(v/v)

        预杂交液:2×SSC,5%硫酸葡聚糖,50%甲酰胺,0.2%脱脂奶粉

        2. 操作方法

        ① 在进行完原位PCR扩增后,用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片,并简洗15min;

        ② 用50%去离子甲酰胺37℃孵育15min;

        ③加预杂交液20μl/片,在杂交温度下孵育30min~2hr。

        二、杂交

        1. 试剂与配制

        杂交液:50%去离子甲酰胺,5×SSC,10%硫酸葡聚糖,5×Denhardt’s 液,2%SDS,10mg/ml变性的鲑鱼精DNA

        2. 操作方法

        ① 弃预杂交液,加杂交液(含0.2~5μg/ml探针)10~20μl/片,覆盖经硅化的盖玻片,石蜡膜封片或橡皮泥封片;

        ② 玻片置于湿盒中,42℃杂交12~18hr(过夜,但不能超过24hr)。

        2. 注意事项

        ① 如果检测mRNA,双链探针应变性处理,方法是95~100℃加热10min后迅速置于冰中骤冷;

        ② 以单链探针检测DNA时,DNA也需变性处理,将玻片置于70~80℃变性液(70%去离子甲酰胺,即甲酰胺/2×SSC,v/v)中10min;

        ③ 用双链探针检测DNA时,可按上述方法变性处理。

        三、杂交后处理

        1. 试剂与配制

        2×SSC

        Rnase(20μg/ml)

        50%去离子甲酰胺

        10mmol/L DTT

        2. 操作方法

        ① 杂交完毕,用2×SSC浸泡玻片数分钟,轻轻移去盖玻片,再用2×SSC洗玻片1~2min;

        ② 2×SSC(含20μg/ml RNase,适宜RNA探针,DNA探针可省略此步)中洗片30min,37℃;

        ③ 2×SSC/50%去离子甲酰胺,42℃×10min;

        ④1×SSC/50%去离子甲酰胺,37℃×30min,2次;

        ⑤ 4×SSC/10mmol/L DTT洗1hr;

        ⑥ 0.1×SSC洗2次,每次37℃×30min;

        ⑦ PBS中洗10min,即可进行显色,方法同上。

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