抗原设计

IgA的纯化血清中IgA的含量较低，一般从乳汁中提取分泌型IgA。 【材料和试剂】（1）人初乳Xml。（2）生理盐水(NS)，HCl。（3）2mol/L Tris，0.1mol/L pH6.3 PB。（4）0.01mol/L， pH7.5(含0.1mol/L NaCl)和0.01mol/L，pH7.7(含0.25mol/L NaCl)的PB。 【操作步骤】 （1）取S ...

制备单克隆抗体骨髓瘤细胞的选择 目前可用于制备McAb的骨髓瘤细胞系较多，这些细胞经药物8-AG、5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)或6-巯基鸟嘌呤(6-TG)诱导出酶缺陷型细胞系，如缺乏次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，因为HGPRT＋细胞利用8-AG后，合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT-细胞能在含8-AG的培养液中生长，或缺乏胸腺嘧啶核苷激酶(TK)和次黄嘌呤-腺嘌呤磷 ...

杂交瘤细胞的保存与复苏 目前冻存细胞均采用-196℃液氮保存，以保持其特性和活性。 1、杂交瘤细胞的冻存 收集培养的杂交瘤细胞或从小鼠体内取出的杂交瘤细胞，加入一定量的细胞冻存液(30～40％小牛血清，50～60％不完全RPMI-1640培养液，10％DMSO)，使细胞浓度为1～5×106个/ml。将细胞悬液分装到1ml冻存管中，先置于-20℃冰箱1h，再移置-80℃冰箱，最后置 ...

制备单克隆抗体骨髓瘤细胞与脾细胞的融合【材料和试剂】 （1）骨髓瘤细胞悬液 选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2）免疫小鼠脾细胞悬液 取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另 ...

制备单克隆抗体杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化培养 1、杂交瘤阳性克隆的筛选 杂交瘤细胞在HAT培养液中生长形成克隆后，其中仅少数是分泌预定特异性McAb的细胞，而且多数培养孔中有多个克隆生长，分泌的抗体也可能不同，因此，必须进行筛选和克隆化。常用方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)，间接血凝试验(PHA)，放射免疫测定(RIA)、直接和间接荧光抗体技术(DFA、IFA)以及免疫酶斑点试验 ...

对产生抗体的细胞克隆进行分析 对产生抗体的细胞克隆，一方面检查其染色体数目，确定是否接近两种亲代细胞染色体之和(约80～100条)。另一方面，取其培养上清或诱生的腹水，检查抗体免疫球蛋白的类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量等。 1、杂交瘤细胞染色体的检查 常采用秋水仙素裂解法。 2、McAb类型、亚型的测定 通常以兔抗小鼠Ig类型和亚类的标准抗血清， ...

人-鼠嵌合抗体 人-鼠嵌合抗体，即抗体的可变区来自小(大)鼠McAb，而恒定区则来自人的抗体。这样的抗体既保持了原来McAb的特异性和亲和力，又大大减少了在人体内的免疫原性。要生产这样的嵌合抗体，第一步也是关键的一步是要从杂交瘤细胞中获得McAb的特定可变区基因，然后再与人的抗体恒定区基因连接，最后将构建好的人-鼠嵌合抗体基因导入骨髓瘤细胞中表达。主要步骤包括制备目的基因、选择载体、将目 ...

ScFv表达载体pFUW80的基因图谱 由于单链抗体可以在大肠杆菌中正确装配、表达，而抗体片段在大肠杆菌中的表达具有规模大、速度快和成本低的优点，目前主要利用原核的大肠杆菌表达载体表达单链抗体。 单链抗体基因的设计应设计理想的连接序列(linker)，以保证VH和VL在表达系统中能等摩尔地产生，不干扰VH和VL的自由折叠，并使抗原结合位点处于适当构型，不引起分子动力学改变，尽可能 ...

嵌合基因的构建（RT-PCR方法扩增VL、VH基因）【材料和试剂】(1) 分泌McAb的杂交瘤细胞(如分泌抗转铁蛋白受体的杂交瘤细胞株)。(2) 细胞培养常用试剂、培养液、器皿。(3) 总RNA提取试剂 Trizol Reagenz。(4) cDNA合成试剂盒。(5) DNA提取试剂及分子生物学技术所需其他试剂和溶液。(6) 核酸修饰酶类：T4DNA连接酶、TaqDNA聚 ...

抗人肺腺癌单链抗体的构建 (1)将表达载体pFUW80质粒经XbaI和EcoRI双酶切，同样双酶切在pUC19中克隆的VL基因，分别回收后，连接并转化大肠杆菌JM109株，鉴定阳性重组子(可通过XbaI、EcoRI双酶切切下合适大小的带，即VL片段)。 (2)将上述经过鉴定的重组质粒用XhoI、SpeI双酶切，回收后，与同样双酶切的在pUC19中克隆的VH基因相连，再次转化JM10 ...

抗体的轻、重链嵌合基因共转染受体细胞目前将重组子导入宿主细胞主要采用的方法有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖街道法介导法、聚季铵盐介导法、原生质体融合法、电转染法以及微注射法。其中以电转染效率较高。【材料和试剂】（1） 小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0细胞或P3X63.Ag8.653细胞，或CHO细胞。（2） 已构建的轻、重链嵌合基因质粒DNA。（3） 脂质体。（4） ...

抗体库技术 抗体库技术的主导思想是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。 从抗体库中筛选多种重要的抗体，如膜蛋白抗原、自身抗原、病毒抗原的抗体。这些显示出抗体库技术的应用潜力。 抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还具有许多独特的优点，令杂交瘤技术难以相比。抗体库技术无需免 ...

基因工程抗体细胞质表达 胞内表达抗体主要采用高表达方式，其表达结果因抗体片段的不同而有较大差异，主要取决于翻译起始位点的设计、片段对蛋白酶的敏感性和宿主菌。高表达抗体的结果常常是以包涵体(inclusion body)形式存在，除载体方面的原因外，这可能与抗体表面疏水性强有关。包涵体可以防止宿主对抗体的降解，并利于纯化。经过变性、复性及去除蛋白的N端甲酰甲硫氨酸或甲硫氨酸，可以得到重新折 ...

基因工程抗体分泌型表达 在表达载体上装入信号肽序列，可以使抗体片段分泌到细胞外或周质腔。在表达时抗体完成切断信号肽，蛋白质折叠，二硫键形成，重、轻链的正确装配等一系列过程，能形成有活性的抗体分子。信号肽可利用已知的PelB以及碱性磷酸酶(PhoA)；外膜蛋白A(OmpA)；A-溶血素蛋白(HlyA)等，将抗体基因两条链分别融合到一种或两种信号肽后面，或者同时融合到同一种信号肽后面。融 ...

基因工程抗体抗体的纯化 对于表达的抗体需要纯化才能准确地进行活性、亲和力的鉴定及应用于临床研究。基因工程抗体的纯化方法与通常抗体纯化方法基本相同。本文主要介绍利用IMAC方法纯化。IMAC的方法原理是利用组氨酸的咪唑基能与二价金属离子，如Cu2+、Zn2+、Ni2+等发生螯合作用，在表达载体的抗体基因插入位点后面设计5～6个组氨酸，这并不影响抗体正确折叠成活性分子，经过一步洗脱，得到 ...

影响免疫亲和层析纯化效果的因素 多种因素影响免疫亲和层析纯化效果，其中最关键的三个因素是：抗原的初始纯度，抗原与抗体的亲和力，以及抗原抗体结合是否容易发生解离。 在免疫亲和层析技术中，抗原的初始相对浓度（即纯度）是决定最终产物纯度极为重要的因素，因为抗原-抗体的反应具有相当高的特异性，还没有任何其他一种层析技术能经过一步纯化得到如此高的纯度。然而，纯化的程度不是无限的，免疫亲和层析 ...

免疫亲和层析使用的抗体的选择 通过实验比较和经验积累才能发现最适合用于免疫亲和层析的抗体（见表2-1）。这意味着没有轻而易举的捷径能选择到最佳的抗体，最好的方法就是进行预实验，来初步测试这些抗体的效果。可用不同的共价交联微珠进行免疫沉淀试验，然后通过免疫印迹法测定结合的抗原量；另一种方法是将抗原溶液通过小型层析柱，然后用免疫印迹的样品缓冲液进行洗脱。一旦确定与抗原结合性能良好的抗体后，下一 ...

免疫亲和层析的基本过程一．概要 对蛋白质（抗原）的纯化率为1000~10000倍 快速纯化抗原，层析柱一般可重复使用 可获得纯化的抗原 不能用于定量测定 纯化效果取决于待纯化抗原的浓度和抗体的亲和力 需要适当纯化的抗体二．操作步骤　基本步骤为：交联 → 结合 → 洗脱（一）交联 1.将抗体结合到蛋白A或蛋白G微珠上。一般情况下，每毫升湿的微珠大约可以结合2mg单 ...

基因工程抗体活性及亲和力的测定 基因工程抗体活性的测定方法主要采用免疫学的常规手段，如免疫荧光技术，免疫酶技术，放射免疫分析技术(RIA)等。表达的抗体片段如Fv、ScFv、VH等缺少完整抗体的恒定区即Fc段，常规ELISA方法中酶标二抗无法与之直接反应，制备可变区的抗体方法又非常复杂和困难，因此，主要采用免疫竞争抑制法，即通过抗体如ScFv与相应McAb对抗原结合的竞争抑制，间接 ...

活化微珠交联的常见问题与解决方法 虽然将抗体有效地与活性微珠交联是一项简单的工作，主要问题是要保持抗体的活性。抗体失活大多是由于抗体与微珠过度交联，或交联发生在抗体的抗原结合片段，使与微珠交联的抗体结合抗原的能力显著低于未交联的抗体。通常能够保持l0~50％抗体活性，这可认为是活性良好水平。在交联过程中，如果抗体的活性远远低于这一水平，可采取下列三种措施保持抗体活性。 （1）在彻 ...