• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        免疫亲和层析的基本过程

        互联网

        10420

        一.概要

        对蛋白质(抗原)的纯化率为1000~10000倍。

        快速纯化抗原,层析柱一般可重复使用。

        可获得纯化的抗原。

        不能用于定量测定。

        纯化效果取决于待纯化抗原的浓度和抗体的亲和力。

        需要适当纯化的抗体。

        二.操作步骤

        基本步骤为:交联 → 结合 → 洗脱

        1. 交联

        ①将抗体结合到蛋白A或蛋白G微珠上。一般情况下,每毫升湿的微珠大约可以结合2mg单克隆抗体或经亲和层析纯化的多克隆抗体。将抗体和蛋白A或G微珠混合成为稀薄的匀浆,在总量为10m1的溶液中加入大约1ml微珠,室温孵育1 h,轻轻摇动混匀。

        ②用10倍体积的 0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)洗涤微珠2次,每次以3000′g离心2min,或10000′g离心30s。

        ③用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)重悬微珠,留取相当于10ml湿微珠的样品。加入足量的二甲基庚二酸酯(固体)至微珠匀浆中,使终浓度为20mmol/L。

        ④室温孵育30min,使结合在蛋白A或G微珠上的抗体与微珠基质发生交联。并轻轻混匀。留取相当于10ml交联微珠的样品。

        ⑤用0.2mol/L乙醇胺(pH8.0)洗涤微珠1次以终止交联反应。然后将其重悬于0.2mol/L乙醇胺溶液中,室温孵育2h,轻轻混匀。微珠用PBS洗涤后,重悬于PBS,加入硫柳汞保存。

        ⑥将交联前和交联后的微珠样品加入Laemmli样品缓冲液中煮沸后,检查交联效果:分别取相当于1ml和9ml两份样品在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳,并用考马斯亮兰染色,如果交联效果良好,在交联前的微珠样品中显示一条55kDa的重链条带,而交联后的样品无此条带。

        2. 结合

        ①将抗体交联的微珠转入合适的层析柱中,用PBS冲洗容器,收集残留的微珠。如果可能,仅使用待纯化制品中全部抗原所需的抗体微珠基质。

        ②用20倍柱床体积与待纯化抗原溶液相同的缓冲液洗柱。

        ③将待纯化抗原溶液加入层析柱,按每毫升柱体积大约1m1/h的流速,使抗原溶液流过层析柱,用蠕动泵控制流速。

        ④ 用20倍柱床体积的结合缓冲液(即PBS)洗柱。

        3. 洗脱

        ①用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱。参见表2-5建议使用的预洗脱缓冲液。

        ②采用分段洗脱法,连续以0.5倍柱床体积的洗脱缓冲液(表2-5)通过层析柱,分管收集每一组分。如果使用过高或过低pH值的缓冲液洗脱,收集管内需加入0.1柱床体积的中和缓冲液(参见表2-5)

        ③检测每管的抗原含量,将浓度高的各管合并。根据抗原的用途,需对收集的抗原洗脱液透析。

        ④ 用20倍柱床体积的起始缓冲液流经基质,使层析柱再生。加入0.01%硫柳汞可长期保存于4℃的环境中。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序