• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        基因工程抗体活性及亲和力的测定

        互联网

        8859
        基因工程抗体活性及亲和力的测定

        基因工程抗体活性的测定方法主要采用免疫学的常规手段,如免疫荧光技术,免疫酶技术,放射免疫分析技术(RIA)等。表达的抗体片段如Fv、ScFv、VH等缺少完整抗体的恒定区即Fc段,常规ELISA方法中酶标二抗无法与之直接反应,制备可变区的抗体方法又非常复杂和困难。

        因此,主要采用免疫竞争抑制法,即通过抗体如ScFv与相应McAb对抗原结合的竞争抑制,间接测定抗体的活性,但需要所表达抗体具有高亲和力。

        另外,可以表达抗体的融合蛋白,如噬菌体抗体的表达,抗体片段如ScFv与M13噬菌体基因Ⅲ产物gp3融合,通过M13 McAb来测定ScFv抗体的活性。

        亲和力(affinity)是指抗体结合部位(可变区)与抗原决定簇的结合强度,是对结合强度的动力学量度。亲和力的表达方式:

        Ab(抗体)+Ag(抗原)=AbAg(抗原抗体复合物)

        Ka为结合常数;Kd为解离常数;按照质量作用定律,复合物形成速率与反应物的浓度成比例,平衡时,结合与解离的速率相等。

        Ka(Ab)(Ag)=Kd(AbAg)

        K=Ka/Kd=Kd(AbAg)

        K=Ka/Kd=(AbAg)/(Ab)(Ag)

        Ka为平衡常数,即抗体结合部位的亲和力。单位为mol-1 。

        抗体亲合力的测定涉及抗体结合部位和抗原决定簇,因此要求抗体和抗原为液体的纯品。目前测定抗体亲和力的方法比较多,如平衡透析法、竞争结合法、荧光增强法、硫氰酸盐洗脱法、酶联免疫测定法(ELISA)和固相放射免疫测定法(SPRIA)等。

        其中ELISA法和SPRIA法是最敏感的检测方法,但其是否依赖抗体的亲和力尚存在争论.通常采用竞争结合及Scatchard作图法。McAb的亲和力通常为1×105 ~1×1012 mol-1 。

        根据质量作用定律,在理想结合反应中:

        (B)=Ka(F)(T-B)

        (B):结合的抗体浓度;(F):游离抗原浓度;(T):总抗体浓度;Ka结合常数。若仅有部分(r部分)抗体参与反应,则有:

        (B)=Ka(F)(rT-B)

        则:(T)/(B)=1/r+1/rKa(F) (1)

        如抗原无限过剩即(F)无限大,则(T)/(B)=1/r。对抗原系列稀释,以T/B为纵座标,1/(F)为横座标作图,当中1/(F)=0时,横座标截距即为r值。可以反应出抗体活性,即10n

        细胞(抗原)结合抗体的最大结合容量(nmol)。利用公式(1)进行Scatchad分析作图,以结合(Ab)/游离(Ab)为纵座标,结合(Ab)为横座标绘制Scatchard图,K为纵座标截距/横座标截距,单位mol-1 。

        【材料和试剂】

        (1) 同位素125 I。

        (2) 抗原为肿瘤细胞。

        (3) 抗肿瘤细胞表面抗原的抗体。

        (4) γ计数仪。

        (5) Sephadex G-75

        (6) 含1%BSA的PBS等。

        【操作步骤】

        (1)用125 I标记抗体。通过Sephadex G-75分子筛分离标志抗体,将125 I-抗体溶于含1%BSA的PBS中,γ计数仪测定计数,即(T)值;

        (2)准备5×106 细胞,用含1%BSA的PBS将细胞进行系列倍比稀释,各管加125 I-抗体(终浓度13ng/ml),37℃温育2h。用PBS洗各管细胞3min,8000r/min离心15s,弃上清,反复3~5次。用γ计数仪对各管测定,即(B)值。绘图,利用横座标为0,计算出r值,即细胞(抗原)的最大结合容量,也就是每个细胞和结合抗体的分子数(nmol)。

        (3)对125 I-抗体(30μg/ml)进行系列倍比稀释,各管加1~2×106 细胞,37℃温育2h,用PBS洗3~5次,用γ计数仪测定。绘制Scatchard图,计算亲和常数(Ka)。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序