基因工程抗体抗体的纯化
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基因工程抗体抗体的纯化
对于表达的抗体需要纯化才能准确地进行活性、亲和力的鉴定及应用于临床研究。基因工程抗体的纯化方法与通常抗体纯化方法基本相同。本文主要介绍利用IMAC方法纯化。IMAC的方法原理是利用组氨酸的咪唑基能与二价金属离子，如Cu2+、Zn2+、Ni2+等发生螯合作用，在表达载体的抗体基因插入位点后面设计5～6个组氨酸，这并不影响抗体正确折叠成活性分子，经过一步洗脱，得到纯度较高的抗体。
【材料和试剂】
（1） Ni-NTA Resin(QIAGEN)。
（2） 大肠杆菌XL1-Blue。
（3） 载体pFUW80
（4） 超声缓冲液：50mmol/L磷酸钠缓冲液pH8.0，含300mmol/L NaCl。
（5） 洗脱缓冲液：50mmol/L磷酸钠缓冲液pH6.0，含300mmol/L NaCl。
【操作步骤】
纯化可溶性胞质表达抗体(ScFv)
（1)将pFS80转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，筛选阳性克隆，接种单菌落于40ml SB培养基(含Amp 100mg/ml；20mmol/L MgCl2 )，37℃培养至OD600 达到0.2，加1mmol/L IPTG，30℃诱导表达过夜。
（2)4000r/min离心10min，收集菌体，用超声缓冲液重悬菌体，每克菌体用2～5倍体积的超声缓冲液。20℃放置过夜，次日在冷水中融化；或者用溶菌酶1mg/ml，冰上放置30min。
（3)在冰上超声破碎菌体，直到核酸释放度达最大(A260)。若裂解物很粘稠，加RNA酶(10μg/ml)和DNA酶 1(5μg/ml)冰上旋转10～15min；或者，用注射器反复吹打数次。
（4)1000r/min离心20min，收集上清，加8ml预先用超声缓冲液平衡的50％SURRY的Ni-NTA Resin柱(直径1.6cm)，每小时上样2～3个柱体积，操作在4℃下进行。
（5)用超声缓冲液洗涤平衡，0.5ml/min，直至A280小于0.01。
（6)用洗脱缓冲液洗柱，直至A280小于0.01。
（7)用洗脱缓冲液pH4.0进行梯度洗脱，紫外检测收集各洗脱峰，SDS-PAGE电泳鉴定。或用咪唑洗脱缓冲液(50mmol/L磷酸钠缓冲液含300mmol/L NaCl，0.5mol/L咪唑，pH6.0)进行0～0.5mol/L咪唑梯度洗脱。
纯化可溶性表达在周质腔的抗体
（1)诱导表达步骤同上。
（2)菌体用30mmol/L Tris-HCl含20％蔗糖，pH8.0的溶液重悬，每克细菌用80ml。在冰上滴加EDTA至浓度为1mmol/L，并温和摇动5～10min。
（3)4℃，8000r/min离心20min，弃去上清，用相同体积预冰冷的50mmol/L MgSO4 重悬细菌，冰上摇动10min。
（4)4℃，8000r/min离心20min，收集上清，即为冷的渗透压休克液。
（5)用超声缓冲液透析，去除EDTA。
（6)以下步骤同前（4)～（7)。
亦可根据各种蛋白的不同及纯化后的应用，可以添加各种试剂，如0.5～1.0％Tween-20；5～10mmol/L β-巯基乙醇；1mmol/L PMSF；增加NaCl浓度及加入10％甘油。
