细胞染色技术

培养细胞常用固定剂和固定方法 培养细胞常用固定剂有4％多聚甲醛磷酸缓冲液、丙酮、甲醇和95％乙醇。在固定之前需用37℃预热的PBS轻洗细胞。 1．4％多聚甲醛磷酸缓冲液 固定10―20分钟，干燥。 2．甲醇 10‰甲醇固定5―20分钟，自然干燥。 3．丙酮 4℃冷丙酮固定组织穿透性和脱水性强，抗原保存好，很少用于组织切片，常用于培养细胞和细胞涂片的固定，平时丙 ...

组织常用固定剂和固定方法 1．甲醛 是常用的醛类固定剂，甲醛(formaldehyde)通过与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白多肽分子间形成亚甲基桥(-CH2-)，蛋白质不再发生改变，保存原位。其特点是组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象发生改变，分子间交联形成的网络结构可能部分和完全遮 ...

Feulgen反应原理及Sohiff液的配制 Feulgen反应是显示DNA的经典而特异的染色方法，由Feulgen(孚尔根)在1924年提出，因而得名。(一)Feulgen反应原理 DNA可在酸性条件下水解，嘌呤―脱氧核糖之间的糖苷键断开，形成醛基(―CHO)，再用 显示醛基的特异性试剂Schiff试剂处理，形成光镜下所见的细胞核内紫红色反应产物。DNA 经稀盐酸处理而水解。除 ...

吖啶橙原值区分组织细胞DNA和RNA的荧光组织化学染色法 1．溶液制备 (1)0．1％吖啶橙浓缩液(避光，4℃保存) 吖啶橙 0．1g 双蒸水 100ml (2)0．067mol／L磷酸盐缓冲液(pH 6．0) 双蒸水 90ml 磷酸氢二钠(Na2 HP04・12H20) 0．34g 磷酸二氢钾(KH2P04) ...

吖啶橙区分活细胞DNA和RNA的荧光组织化学染色法 吖啶橙《acridine oran。AO)属于三环杂芳香类异嗜性阳离子荧光染料，主要以两种方式与核酸结合，一是嵌入核酸双链的碱基对之间；二是与单链核酸的磷酸发生静电相互作用。当吖啶橙与DNA或RNA结合时，最大发射波长分别为525nm或650nm，产生绿色荧光或橙红色荧光，因此，吖啶橙是研究核酸的一种常用荧光组织化学染料。下面介绍应用吖啶 ...

Hoechst 33258染色 1．原理 Hoechst 33258和Hoechst 33342均为非嵌人性荧光染料。它们在活细胞中 DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中 摄取该染料。从而使细胞核着色。故又把此类染料称为DNA探针。Hoechst 33342和Hoechst 33258均可溶于水并在水溶液中保持稳定。Hoechsr-DNA的激 ...

溴化乙啶染色 1．原理 溴化乙啶(ethidium bromide，EB)是最常用的嵌入性荧光染料，活细胞或固 定细胞均能从极稀溶液中摄取EB染料，DNA螺旋暂时弯曲允许EB荧光染料嵌入大分子 疏水中心的碱基对之间。标本经强酸(0．25mol／LHCl，pH 0．6)水解破坏RNA后，可特异 地显示DNA，而标本经0．1mol／L盐酸的无水甲醇处理(55℃，3小时)，使DNA甲基化 ...

DAPI染色 1．原理 DAPI为4’，6二脒基-2-苯吲哚(4’，6―diamidino-2―phenylindole)能与双链DNA小槽，特别是AT碱基结合，也可插入少于3个连续AT碱基对的DNA序列中。当它与双链DNA结合时，荧光强度增强20倍，而与单链DNA结合则无荧光增强现象，因此是一种简易、快速和敏感地检测DNA的方法。DAPI的荧光强度虽较Hoechst低，但荧光稳定性优于 ...

碘化丙啶染色 1．原理 碘化丙啶(propidium iodide，PI)不能穿人完整的活细胞膜中，即正常细胞和凋亡细胞在不固定的情况下对PI拒染，而坏死细胞由于失去膜的完整性，PI可进入细胞内与DNA结合，根据此特点，使用PI染色可鉴别死细胞。如果对活细胞染色必须在染色前进行固定，以增加细胞膜对染料的通透性。 2．溶液配制 使用0．01mol／LPBS(pH 7．4)配制终浓 ...

酶组织化学的基本原理 酶组织化学是显示酶的活性，即显示酶的催化作用，而不是酶本身，酶本身并不发生反应。在一定pH和适宜温度条件下，组织或细胞中的酶与孵育液中的特异性酶作用底物反应．催化底物形成无色初级反应产物，后者再与某种捕捉剂结合，形成有色的终产物沉淀于酶所在部位，使组织切片中的酶变成显微镜下的可见物。倘若此反应产物仍然无色，则需再经置换剂处理，使五色的反应产物沉淀被置换为有色的最终反应 ...

乙醇苏丹黑B脂类染色法 苏丹染色法常用染料有苏丹黑B(Sudanblack-B)、苏丹Ⅲ和苏丹Ⅳ。这类染料均可使 中性脂肪着色。苏丹黑B为重氮染料，能使中性脂肪呈蓝黑色，显示磷脂效果最好；苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ为红色染料，后者比前者显色更强。 当组织切片置于染料时，苏丹黑B离开染液而溶于组织内的脂滴中，使组织内的脂类着色。由于苏丹黑B可与大多数脂类高度结合，故在组织化学上常用此法作为脂类 ...

脂类组织化学与酶组织化学 脂类(lipid)是构成细胞结构的成分之一，可分为脂肪(fat)和类脂(1ipoid)两大类。脂肪系指甘油三酯，以脂滴形式存在于细胞质内。类脂是一些与脂肪酸结合可形成酯的物质，包括胆固醇、固醇酯、磷脂和糖脂等。在组织化学上，根据染色性质不同可把脂类分为酸性脂类和中性脂类。酸性脂类包括脂肪酸和磷脂等，中性脂类包括甘油三酯、胆固醇、固醇酯、类固醇及某些糖脂等。 ...

碱性磷酸酶钙―钴法 磷酸酶(phosphatase)是水解磷酸酯酶的总称。磷酸酶不仅参与磷酸酯化合物的水解反应。而且也参与其逆反应及磷酸转移反应。 1．碱性磷酸酶 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)在碱性环境下可催化各种酚和醇的磷酸酯水解，还具有磷酸转移作用，在细胞膜上运输作用较为活跃，如肾近端小管的刷状缘、小肠上皮的微绒毛、肝脏的胆小管、毛细血管内皮细 ...

酶组织化学对组织处理的基本要求 在酶组织化学研究中，仍需遵循标本制作五大基本步骤，即固定或不固定的标本、切片(冷冻或不冷冻)、孵育、显色和显微镜下观察。 根据组织化学酶检出的基本步骤。主要有以下5方面影响酶活性： 1．选择最适温度、pH及缓冲液。 2．固定和切片标本制作 由于固定液易使酶丧失酶活性，因此最好用不固定的冰冻切片显示酶活性。切片厚度一般为8～12um， ...

酶组织化学酶显示方法 1．偶联偶氮色素法 此法又称偶氮色素法(couplingazo dyemethod)，是指用某种人工合成底物在酶作用下产生分解产物，分解产物与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性偶氮色素，以此对酶定位。常用的底物是萘酚系列化合物，如l―萘酚、2―萘酚、6―溴―2―萘酚、萘酚AS、萘酚AS衍生物等。由于重氮盐的种类不同，偶氮色素的颜色也不同，可显示出紫色、蓝色、红 ...

碱性磷酸酶偶氮―偶联法 人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚，后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素。 1)孵育液配制 萘酚AS(或萘酚AS-MX) 10―25rug N，N―二甲基甲酰胺液 &n

非特异性酯酶组织化学染色法 羧酸酯水解酶或称酯酶(esterase)，是一类水解酯的酶，其作用是水解脂肪族酯和芳香族酯，催化反应式如下： 一般所指的酯酶是非特异性酯酶，无底物特异性。广义的酯酶包括特异性酯酶，有底物特异性。各种酯酶水解的底物和最适pH不尽相同。 非特异性酯酶主要定位于内质网和溶酶体，也可少量存在于线粒体和胞液内。它主要参与酯类代谢，也与蛋白质代谢有关。非特异性酯 ...

酸性磷酸酶金属盐―铅法 酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)广泛分布于机体各种组织细胞内，主要存在于细胞的溶酶体内．常作为溶酶体标志酶，此外，还存在于内质网和胞质内。在组织退行性变、核酸和蛋白质代谢活动增加时，酸性磷酸酶活性增强。酸性磷酸酶还参与酯类代谢。因此，它在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中具有一定生物学意义。 其基本原理是在酸性环境下，底物p―甘油磷酸 ...

酸性磷酸酶重氮盐后偶联法： 与碱性磷酸酶相同。重氮化和偶联反应多在碱性溶液中和低温条件下进行。在酸性溶液中容易分解。所以酶作用与偶联反应分两步进行。 1)孵育液配制 磷酸―6―苯酰-2-萘钠 25rug 蒸馏水 80ml Wapoll醋酸缓冲液(pH 5．0) 20ml 氯化钠

葡萄糖-6-磷酸酶组织化学染色法 葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6―phosphatase，G-6―P)定位于肝、肾、肠黏膜的微体及内质网内。主要有两方面的生理功能：一方面通过水解葡萄糖-6-磷酸释放葡萄糖来控制葡萄糖释放人血的量；另一方面，在一定条件下通过其磷酸转移酶活性合成葡萄糖-6-磷酸。糖尿病患者血糖浓度增高的同时，伴有葡萄糖-6-磷酸酶的磷酸转移酶活性增高，其作用是取代肝内 ...