碱性磷酸酶偶氮―偶联法
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碱性磷酸酶偶氮―耦连法
人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚，后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素。
1)孵育液配制
萘酚AS(或萘酚AS-MX) 10―25rug
N，N―二甲基甲酰胺液 0．5ml
0．2mol／LTris盐酸缓冲液(pH 8．2―9．2) 50ml
坚牢蓝B(或BB、RR，或坚牢红TR、坚牢蓝VRT) 50mg
混合、搅拌及过滤，必要时可使用氢氧化钠调整pH。
2)操作程序：
①新鲜组织冰冻切片：
②人孵育液，37C(或室温下)孵育5―60分钟；
③双蒸水洗3～5分钟；
④4％甲醛，室温下固定10～15分钟；
⑤蒸馏水洗3～5分钟；
⑥甘油明胶封固。
3)结果与评价：
采用不同的重氮盐。酶的活性显色也不同，用坚牢蓝B(或BB、RR)酶活性呈蓝紫色，用坚牢红TR(或坚牢紫B)酶活性呈红色。萘酚法有三个优点：
①反应产物溶解度小。局部比较明显；
②萘酚化合物能较快地被水解，可缩短孵育时间；
③反应产物立即可见，并显示出颜色。
4)对照实验：方法与钙―钴法相同。
