碱性磷酸酶钙―钴法
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碱性磷酸酶钙―钴法
磷酸酶(phosphatase)是水解磷酸酯酶的总称。磷酸酶不仅参与磷酸酯化合物的水解反应。而且也参与其逆反应及磷酸转移反应。
1．碱性磷酸酶 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)在碱性环境下可催化各种酚和醇的磷酸酯水解，还具有磷酸转移作用，在细胞膜上运输作用较为活跃，如肾近端小管的刷状缘、小肠上皮的微绒毛、肝脏的胆小管、毛细血管内皮细胞及神经元的突触膜均可显示此酶活性。
在碱性环境(；pH 9．2～9．4)中，碱性磷酸酶将磷酸盐的底物(如β-甘油磷酸钠，α-萘酚磷酸钠)分解，产生的磷酸离子被孵育液中的钙离子捕获生成磷酸钙沉淀。因磷酸钙不能显色，需加入硝酸钴，用钴离子置换钙离子，形成磷酸钴沉淀后用硫化铵处理，形成棕黑色硫化钴颗粒沉淀，从而显示酶活性部位，硫化钻沉淀的多少与碱性磷酸酶含量成正比，其反应通式
碱性磷酸酶钙-钴法反应原理
1)孵育液配制
2％氯化钙 20ml
2％巴比妥钠 10ml
3％β甘油磷酸钠 10ml
5％硫酸镁 5ml
蒸馏水 5ml
孵育液最终pH 9．4,置于冰箱内保存。
2)染色程序：
①新鲜组织恒冷箱切片(可用10％福尔马林固定10分钟，或不固定)；
②人孵育液，37C~孵育10分钟(肾)至 60分钟(肝)；
③流水冲洗；分钟；
④人2％硝酸钴溶液2分钟；
⑤蒸馏水浸洗；
⑥人1％硫化铵溶液内1分钟；
⑦蒸馏水洗；
⑧甘油明胶封固。
3)结果与评价：酶活性部位显示棕黑色为硫化钴沉淀。该法的反应产物可发生扩散，定位欠准确，应加以注意。
4)对照实验：加入抑制剂L四咪唑等结果为阴性；去底物(孵育液中用10ml蒸馏水代替底物)结果为阴性。
碱性磷酸酶钙-钴染色
大鼠小肠绒毛吸收细胞呈深棕色为碱性磷酸葱阳性反应
