免疫学技术

胶体金标记蛋白的制备【基本原理】 胶体金标记实质上是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附的机理可能是胶体金表面所带的负电荷与蛋白质分子所带的正电荷之间靠静电力相互吸引，达到范德华引力内即形成牢固的结合。另外，胶体金颗粒的粗糙也是有利于形成吸附的重要条件。由于这种标记过程主要是靠物理吸附作用，因而对蛋白质分子的生物学活性没有明显影响。【试剂及材料】（1）胶体金溶液（2） ...

放射免疫分析技术(用核素标记的抗原检测抗原)【基本原理】 放射免疫分析技术（radioimmunoassay，RIA）一般采用竞争结合分析技术。其基本原理为放射性标记抗原和被测抗原（或标准品）对有限的特异性抗体发生可逆性的竞争结合反应，最终形成的放射性抗原-抗体复合物量与被测物的含量呈负相关。当抗体的量固定不变时，免疫复合物的形成就受到待测抗原含量的制约。如反应系统中待测Ag含量高时，对A ...

斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS） 1984年，Moeremans等将斑点酶联免疫吸附法（dot-ELISA）与免疫金银染色法相结合，建立了固相载体上的斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS）。蛋白质抗原通过直接点样或转移电泳吸附在硝酸纤维素膜（NC膜）上，与特异性抗体反应后，在滴加（或浸入）胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的 ...

斑点金免疫渗滤测定法（dot immunogold filtration assay，DIGFA）【基本原理】斑点金免疫渗滤测定法是在斑点免疫渗滤测定法基础上，改用胶体金标记物代替酶，省去底物显色的步骤。试验方法是以硝酸纤维素膜（NC膜）为载体，将试剂及标本滴加在膜上，通过渗滤而逐步反应。全过程可于数分钟内完成，阳性结果在膜上呈红色斑点。【试剂及材料】（1）渗滤装置：为一塑料小盒（4x3x0. ...

PCR反应体系的三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)&nbs

标准PCR方法典型的PCR扩增必须具备下述基本条件以构成PCR反应体系：10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液： 10～50 mmol/L Tris-HCl (pH7.5～9.0) 6～50 mmol/L KCl或 (NH4)2SO4 1.5～5 mmol/L MgCl2或 MgSO40.2 mmol/L dATP dCTP dGTPdTTP0.1～1μmol/L ...

PCR反应体系的模板 几乎所有形式的DNA和RNA都是PCR反应的合适底物，包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA。大多数PCR操作中对DNA模板的要求都不高纯度要求亦不严用量很低。理论上单拷贝基因都可以扩增但从高度复杂的DNA样品中进行扩增可能比从质粒、噬菌体中进行扩增要困难些，如在PCR反应前用机械剪切或稀有限制酶消化基因组DNA可提高产量。 ...

PCR反应体系的耐热DNA聚合酶 DNA的体外扩增是由许多不同来源的DNA聚合酶完成的。对PCR而言，热稳定DNA聚合酶（如Tag、Vent和pfu）优于热不稳定聚合酶（如T4、T7和Klenow），因为它们更易操作和实现自动化，其中以Taq DNA聚合酶的应用最为广泛。Taq DNA聚合酶的分子量为94kD这种酶不显示任何3，→5，核酸外切酶活性它的最适反应温度在75℃左右对95℃的变温 ...

PCR反应体系的Mg2+的浓度 Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外也影响引物的退火 模板与PCR产物的解链温度产物的特异性引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时酶活力明显降低;过高时酶可催化非特异性扩增。PCR中Mg2+浓度在0.5～2.5mmol/L之间。如果溶液中存在EDTA或在引物贮备液中有其他螯合物或者DNA模板会干扰Mg2+的浓度。因此 ...

PCR反应体系的其他优化策略 1、增强剂：一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG-6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%～10%）和牛血清白蛋白（10～100μg/ml）等可以加到反应中以提高特异性和产量。有些反应只能在这些辅助物存在时才能扩增。2、热启动PCR：Tag酶在低温下仍有活性，当所有的反应成分混合后进入循环前，一些非特 ...

PCR常见问题及处置 1、没有扩增产物形成： ①循环温度，特别是解链温度是否确切，注意PCR仪的指示温度是否与实际温度相符； ②引物的组成是否正确，有无二级结构的形成； ③聚合酶活性是否正常； ④反应系统有无蛋白酶或核酸酶的存在，使聚合酶或模板及产物降解，可在95℃以上处理反应系统使其灭活； ⑤某些来源的DNA可能有较难去除的蛋白质成分抑制PCR系统用蛋白 ...

白细胞标本DNA PCR反应模板的制备 方法一 【试剂与配制】蛋白酶K：20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5TE缓冲液（pH7.5 或8.0）PBS（磷酸盐缓冲液）钾缓冲液：50mmol/L KCl10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)，1%laureth12 ，0.5% Tween-20，蛋白酶K（100μg/m ...

固定和包埋的组织标本DNA PCR反应模板的制备 石蜡包埋组织和其他固定组织代表档案标本。由于PCR可以扩增相对于完整的染色体DNA来说较短的DNA片段，而且在一定程度上可接受降解的DNA，所以固定组织适用于分子遗传学研究。这些组织是前瞻和回顾性分子遗传学和感染疾病研究的巨大资源。大部分固定和包埋组织标本经福尔马林固定，分析前样品大多要进行脱蜡和水化，再用蛋白酶消化。 【试剂与配制】（ ...

点杂交膜的制备 当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。通过将PCR 产物固定于尼龙膜和硝酸纤微素膜上，再用标记的探针进行点杂交。点杂交可检测突变DNA的突变类型，而应用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。 方法有二：一是将PCR产物固定至膜上，液相中的探针与其杂交；二是将多种探针固定于同一膜上不同区域，再与液相中的PCR产物杂交，根据阳性位置即可判断产物的类型。1．PCR产物的固定 ...

点杂交的检测 现在大多数的实验室里，常用的标记物为地高辛和生物素，下面主要介绍这两种标记系统的显色方法。1． 地高辛标记探针和PCR引物【试剂与配置】缓冲液Ⅰ：150mmol/L NaCl 100mmol/L Tris-HCl (pH7.5)缓冲液Ⅱ：0.5%阻断剂溶于缓冲液Ⅰ缓冲液Ⅲ：100mmol/L NaCl 100mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，50mmol/ ...

PCR产物的检测点杂交1．寡核苷酸探针杂交 【试剂与配置】 预杂交液：5×SSC，5×Denhadrt 0.5%Triton X-100 2×SSC/0.1%SDS 1×SSC/0.1%SDS 0.1×SSC/0.1%SDS 【操作方法】 (1) 将2×SSC湿润的杂交膜放入50ml试管中，再加入5～10ml预杂交液，盖上盖子； （2）置于杂交炉中，在杂交温度下（比探 ...

PCR产物的检测PCR-ELISA法 在一个引物的5’端标记上生物素以便使其能与包被板上的亲合素结合而固定PCR产物，而在另一引物的5’端标记FITC，用HRP标记的抗FITC抗体与之结合显色，即可进行常规ELISA检测。如设立标准对照，此技术还可用于定量分析。【试剂与配置】 包被液：4.3mmol/L Na2HPO4 1.4mmol/L K2HPO4 0.05% (w/v) Twee ...

直接IM―PCR (以rhIL-3的检测为例)【试剂与配制】TBS：20mmol/L Tris-HCl（pH7.4），150mmoI/L NaCL封闭液：1.5％ BSA （用TBS配制）抗hIL-3单抗生物素化羊抗鼠IgG亲合素DNA指示分子(生物素―AdAT)PCR反应液：5×PCR缓冲液10μl，dNTP 4μl，引物4μl，EP-DNA聚合酶0.5μl蒸馏水31.5μl【操作方法】 ( ...

免疫PCR(IM-PCR)注意事项 (1)固相载体的选择：主要取决于抗原在固相载体上的吸附程度。如果抗原吸附良好，可以进行IM-PCR。如果抗原吸附不良，则需选用双抗体夹心IM―PCR。另外选用的固相载体要和PCR仪器相匹配。一般用0.5ml的塑料反应管，也可以用微量滴定板。 (2)待检抗原的特异性抗体：这是决定本法特异性和敏感性的关键试剂，使用相应的McAb为宜。将抗体进行生物素 ...

间接IM―PCR (以神经肽Y的检测为例)【试剂与配制】（1）TBS：20mmol/L Tris-HCl（pH7.4），150mmoI/L NaCL（2）封闭液：1.5％ BSA （用TBS配制）（3）抗神经肽Y单抗（4）兔抗神经肽Y抗体（5）生物素化羊抗兔IgG（6）亲合素（7）DNA指示分子(生物素―AdAT)（8）PCR反应液：5×PCR缓冲液10μl，dNTP 4μl，引物4μl，EP- ...