直接IM―PCR (以rhIL-3的检测为例)
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直接IM―PCR (以rhIL-3的检测为例)
【试剂与配制】
TBS：20mmol/L Tris-HCl（pH7.4），150mmoI/L NaCL
封闭液：1.5％ BSA （用TBS配制）
抗hIL-3单抗
生物素化羊抗鼠IgG
亲合素
DNA指示分子(生物素―AdAT)
PCR反应液：5×PCR缓冲液10μl，dNTP 4μl，引物4μl，EP-DNA聚合酶0.5μl,蒸馏水31.5μl
【操作方法】
(1) 用TBS稀释rhIL-3至6.0μg/ml～6.0×10-8
μg/ml；
(2) 取50μl rhIL-3稀释液加至0.5ml塑料离心管中，4℃过夜,弃上清液；
(3) 每管中加封闭液30μl，37℃静置2h，弃去液体，用TBS洗一次；
(4) 加50μl抗hIL-3单抗(1:40),温育30～60min后用TBS洗涤；
(5) 加入50μl生物素化羊抗鼠IgG(1:500),温育后洗涤如上；
(6) 加入50μl亲合素(10ng/ml),温育后洗涤如上；
(7) 加50μl DNA指示分子10ng/ml,温育后洗涤如上；
(8) 加50μl PCR反应液,25μl石腊油,离心5s；
(9) PCR扩增:94℃×60s,55℃×60s,71℃×120s,30个循环后71℃延伸5min；
(10) 取5μl PCR扩增产物加于2％琼脂糖凝胶上电泳；EB染色，紫外灯下拍摄结果，激光扫描定量。
