免疫学技术

在免疫酶技术中，有时需要将样品液（如抗原、抗体、酶、酶标抗体或酶标抗原）浓缩。常用的浓缩技术如下：1.反透析法如果在装有样品液的透析袋周围放上浓度很高的且具有吸水作用的多聚物或蔗糖，由于膜内渗透压比膜外低，膜内样品液中的蛋白质进行浓缩。常用的多聚物有聚乙烯吡咯酮（Polyvinylpyrrolidone简称PVP，分子量约12000）、聚乙二醇（Polyethylene glycol简称PEG亦称 ...

一，酶免疫电泳技术的原理抗原与抗体在琼脂糖凝胶中电泳时，在碱性缓冲液的条件下，抗原带负电，向正极移动。不同分子量或还不同电荷的抗原，在相同条件下，移动距离不等。这些在不同部位的抗原，再与相关抗体经扩散形成免疫沉淀线。酶免疫电泳技术中的抗原与抗体就是酶和它的相应抗体球蛋白。酶抗原与酶抗体形成的免疫复合物是用底物显色的，由于酶反应的高度灵敏性，使酶免疫电泳技术成为一项灵敏度高的检测技术，但仅局限于酶蛋 ...

（1）将初步纯化的SPA与HRP用过碘酸钠氧化法（交联反应时间在22℃下5h）交联。 （2）将上述PPA溶液过Sephadex G-100柱，条件同前。所收集的第1管至第22管的合并液，是PPA存在的主要组分，可用ELISA塑料平板法检测活性。将合并液浓缩，然后加入30%左右甘油，贮于4℃冰箱备用 PPA的使用: (1) PPA-ELISA法。基本上与ELISA法相同，PPA代替了酶标抗抗体。在 ...

内源性干扰因素一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体、交叉反应物质等。在日常的临床血清（浆）标本中，有相当比例不同程度的含有上述各种干扰物质，从而导致测定结果的假阳性。 1.类风湿因子（rheumatoid factorsRF）在类风湿患者、其他疾病以及正常人血清中常含有较高或不同浓度的RF，RF一般为TgM型，亦有 ...

由于在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。因此，需要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素标记方式、同型对照等。 流式抗体的选择： 1 流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择最基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。 2 流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过 ...

微流式细胞分析术（Personal Flow Cytometry）是采用微毛细管流式技术（Microcapillary）对液流中形成单细胞流的细胞或其它生物微粒（如人工微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行绝对计数和快速定量分析的技术。作为下一代的流式检测技术平台，微流式细胞仪诞生于上世纪九十年代。经过近二十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经接近成熟，并被广泛的运用于从基础研究到工业生产的各个方 ...

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术。作为应用流式细胞术进行检测的技术平台，现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经过近四十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟，并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床 ...

SABC法：ABC代表的是亲和素－生物素－过氧化物酶复合物。利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。SABC（链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物）就是StreptAvidin Biotin Complex的英文缩写。这一方法集中体现了目前最先进的免疫组化所必必具备的高敏感性、特异性及操作快速、简便的所有特征。 基本原理：亲和素（Avidin）存在于鸡蛋中，分子量67000。是一种碱 ...

1. 洗衣粉液浸泡 30 分钟，冲洗，晾干。 2. 洗液 （含强酸、高锰酸钾等）浸泡 24 小时，冲洗，晾干。 3. APES（1:50 丙酮溶液） 10-20 秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架） 。 4. 纯丙酮 I ，约 10 秒。纯丙酮 II ，约 5 秒 5. 晾干或烤箱内烤干，备用。 ...

一、对照组的设置： 在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是绝对值。如需知道绝对值 时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。 1. 阴性对照的设置 ① 在实验过程中，如做间接标记法，可设置与一抗无关的实验，即在 实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照 管，作为阴性对照。 ② 在实验过程中，假设做直接标记法，可设置理论上的阴性细胞作为 阴性对照管， 实验过程及步 ...

1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片( 也可- 80℃保存)，厚度为 5～6μm。 2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。 3. 如不马上染色，可密封后- 20℃保存。 4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分钟。 5. PBS 洗 2 次，每次 5 分钟，( 必要时应用 0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔) 6. 3% H2O2灭活内源性过氧化物 ...

1. 取第二轮筛选得到的阳性克隆贮存液上清。 2. 将过夜培养的 XL1-blueMRF' 细菌 2000 转/ 分离心 10 分钟，将细菌溶解在10mMMgSO4 中，调整细菌溶度到 OD600=1.0。 3. 在一个 EP 管中加入：200ul XL1-blueMRF' 细菌+250ul phagestock（步骤 1）+1 ul ExAssisthelper phage。 ...

间接标记法 1. 制备单细胞悬液； 2. 细胞计数，取出 1×106 个细胞于试管中； 3. 用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90～95%； 4. 在试管中加入一抗， （剂量按照说明书的要求） ，孵30育～60 分钟； 5. PBS 洗涤 1～2 次，1500rpm，离心 3 分钟，弃上清； 6.加入二抗，孵育 20～30 分钟； 7. PBS 洗一次，15 ...

1. 将 E.coli /phagelysate 以 1:10-20 稀释在 TBST溶液中。 2. 将 4 张 82mm 的 nitrocellulosemembranes（NC）浸入稀释后的 E.coli/ phage lysate中，室温下水平摇动 30 分钟，取出 NC 并使膜沥干。 3. 用 50mlTBST 溶液洗膜 3 次，每次 10 分钟。 4. 用滤纸轻轻吸去膜上的液体。 5. ...

1. 取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定 20~30 分钟。 2. 蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。 3. 打孔液浸泡 5 分钟。 4. 蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。 注：第 3、4 步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。 5. 正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 （保持组织呈湿润状态）滴加正常山羊或兔血清 （与第二抗 体 同源动物血清）处理，37℃ ...

一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤： 1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置 60℃ 1 小时） 。 二甲苯 、II各 10 分钟。 梯度酒精：100%，2 分钟 95%，2 分钟 80%，2 分钟 70%2 分钟。 蒸馏水洗：5 分钟，2 次（置于摇床）。 2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O 2，室温 10 分钟（避光） ...

1. 将藻酸钠溶于无菌生理盐水，终浓度为 1.5%； 2. 收集培养的肿瘤细胞，用无血清的培养基洗涤1 次，将细胞沉淀重悬于1.5%藻酸钠溶液中； 3. 将上述肿瘤细胞悬浮液用 1 ml 加样枪缓慢滴入磁力搅拌的 250 mMCaCl2 溶液中，形成乳白色的藻酸盐小珠。继续静置于 250 mMCaCl2 中 30 min 即可 使用。以上操作步骤均在无菌条件下进行； 4. 将第 4 ...

1. PBS 溶解抗原为 30 μ g/ml，加 100 μ l/孔于 PVDF 膜铺底的 96 孔灭菌板过夜； 2. 第二天吸去包被液后，加 5％FCS 的 PRMI 1640 培养基 100 μ l 封闭 1 小时，37℃； 3. 准备脾细胞悬液（用氯化铵去除红细胞，制备成单个脾淋巴细胞悬液） ； 4. 从 1 × 106/ 孔开始，按 1:3的稀释度开始逐孔稀 ...

一、包被抗原 1. 用 50mM 的碳酸盐包被缓冲液 （pH 9.6） 溶解抗原， 使抗原浓度为 10-20 μg/ml，加 100 μ l/孔到 96 孔酶标板，4℃放置过夜。 2. 第二天弃去包被液后，用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μ l 1％ BSA 37℃封闭 1 小时。 3. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清 ...

一、裂解细胞 1. 收集细胞。将培养瓶置于冰上，倒掉培养基，用PBS 或生理盐水漂洗两 次，留适量液体于瓶内，然后用特制的细胞刮棒朝一个方向刮取细胞。 将细胞悬液转移到离心管，离心取沉淀，-80℃ 保存。 （收集细胞要迅速， 低温下进行，以减弱蛋白酶的作用） 2. 裂解细胞。采用 RIPA裂解体系，使用前 4℃ 预冷，按 107 个细胞加入 1.0ml 裂解液，吹打混匀，加入适量的蛋 ...