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        ELISPOT实验技术操作流程

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        2782

        1. PBS 溶解抗原为 30 μ g/ml,加 100 μ l/孔于 PVDF 膜铺底的 96 孔灭菌板过夜;

        2. 第二天吸去包被液后,加 5%FCS 的 PRMI 1640 培养基 100 μ l 封闭 1 小时,37℃;

        3. 准备脾细胞悬液(用氯化铵去除红细胞,制备成单个脾淋巴细胞悬液) ;

        4. 从 1 × 106/ 孔开始,按 1:3的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度,并做 3 个复孔,37 ℃ 静置培养 5 小时;

        5. PBS 洗 3~5 次,生物素化的抗鼠 IgG二抗孵育 30 min;

        6. PBS 洗 3~5 次,链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育 30 min;

        7. PBS 洗 3~5 次,用底物BCIP/NBT显色,显微镜下观察显色反应,显色后及时终止反应;

        8. 计数每孔中的斑点数目,计算每 106 个脾细胞中抗体分泌细胞数量。

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