细菌单克隆剪切步骤

1. 取第二轮筛选得到的阳性克隆贮存液上清。

2. 将过夜培养的 XL1-blueMRF' 细菌 2000 转/ 分离心 10 分钟，将细菌溶解在10mMMgSO4 中，调整细菌溶度到 OD600=1.0。

3. 在一个 EP 管中加入：200ul XL1-blueMRF' 细菌+250ul phagestock（步骤 1）+1 ul ExAssisthelper phage。

4. 将以上三种样品混合，37℃下共同保温 15 分钟。

5. 将样品混合物加入到 3 ml LB 培养基中，37℃震荡培养 3-4 小时。

6. 将试管放于 65-70℃水浴 20 分钟，3000 转/ 分，离心 15 分钟。

7. 将上清转入新的离心管中，已发生剪切的 phageparticles在上清中（上清可在 4℃下储存 1-2 月） 。

8. 将 100ul phage 上清+200ul SOLRcells（OD600=1.0）混合，37℃保温 15 分钟。

9. 取步骤 8 中溶液 5- 10 ul 涂于 LB-ampagar plates（amp=50ug/ml） ，过夜培养。

10. 第二天细菌长出，随机挑取单克隆接种到 LB-amp 培养基中培养过夜。

11. 过夜培养细菌分为三部分：

① 提取质粒做双酶切，鉴定外源基因的大小；

② 送样品进行 DNA 测序

③ 加入 30-40%的甘油进行保种，分装成小份储存于- 80℃备用。