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        ELISA实验操作流程及注意事项

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        13954

        一、包被抗原

        1. 用 50mM 的碳酸盐包被缓冲液 (pH 9.6) 溶解抗原, 使抗原浓度为 10-20 μg/ml,加 100 μ l/孔到 96 孔酶标板,4℃放置过夜。

        2. 第二天弃去包被液后,用 PBST 洗涤 3 次,每孔加入 150 μ l 1% BSA 37℃封闭 1 小时。

        3. PBST 洗涤 3 次后,每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清,并加入对照样品,37 ℃ 孵育 2 小时。

        4. PBST 洗涤 5 次后, 加入100μ l 稀释后的 HRP 标记的二抗, 37℃孵育 1 小时。

        5. PBST 洗涤 5 次后,显色剂显色 20 min 后,酶标仪上读取 A 405 吸收值。

        二、包被细胞

        1. 在 96 孔培养板上接种细胞数为 1 x 104 cells/well,37℃过夜培养。

        2. 第二天用 PBS 洗涤培养板 2-3 次。

        3. 加入 125 μ l/well10% Formalin(1:10 稀释),室温下固定 15 min。

        4. 用 ddH2O 洗涤培养板 3 次,并晾干,储藏在 2- 8 ℃ 备用。

        5. 用 PBST 洗涤 3 次,每孔加入 150 μl 1% BSA 37 ℃ 封闭 1 小时。

        6. PBST 洗涤 3 次后,每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清,并加入对照样品,37 ℃ 孵育 2 小时。

        7. PBST 洗涤 5 次后, 加入100 μl 稀释后的 HRP 标记的二抗,37 ℃ 孵育 1 小时。

        8. PBST 洗涤 5 次后,显色剂显色 20 min 后,酶标仪上读取 A 405 吸收值。

        ① 50mM 的碳酸盐包被缓冲液:0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃,保存,Na2CO3 0.15 克,NaHCO3 0.293 克,蒸馏水稀释至 100 ml。

        ② ABTS 作为底物进行显色反应(10ml):0.2M Na2HPO4 2.4ml ;0.1M 柠檬酸 2.6ml ;ddH2O 5ml ;ABTS 5mg;H2O2(30%) 4 ul (用前加入)

        注 意:

        1. 一般做倍比稀释进行检测,需要有相应的对照血清。

        2. 不同的显色系统对应不同的光吸收值

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