PCR技术

做半个月RT-PCR了，内参条带没问题，可是目的基因始终不露面。使我的模板有问题马？下面是我测得总RNA的OD:0.133{A230}、0.270{A260}、0.133{A280}、0.08{A320}.A260/A280=2.03 、A260/A230=2.03我得模板零下80放了一年多，现在做RT-PCR，退火温度、镁离子浓度、循环数都试过来了，老是不出结果，我都不知道下部要怎么做了。。。。郁闷死了。下面使我的试验步骤， 烦请各位高手帮帮 ...

我现在急需做试验，但是我的引物还没有设计出来，所以万分着急。我想做XIAP 的RT-PCR，我现在找到它的mRNA序列为1 gaaaaggtgg acaagtccta ttttcaagag aagatgactt ttaacagttt tgaaggatct61 aaaacttgtg tacctgcaga catcaataag gaagaagaat ttgtagaaga gtttaataga121 ttaaaaactt ttgctaattt tccaagtggt agtc ...

SNP(Single nucleotide polymorphism) 即单核苷酸多态性， 指的是由单个核苷酸—A,T,C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成染色体基因组的多样性。所以，SNP可导致人类疾病，如癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病等，SNP是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据，因此被广泛用于群体遗传学研究和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。 分类： 根据 SNP 所处的位置，可将 SNP 分为蛋 ...

本版块发帖量实在太多，因此分2个帖（上中旬和中下旬）分别帖出0应助贴，望大家积极响应，呵呵，有点浩如烟海的感觉哦http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=3091491&sty=1&tpg=34&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=3085000&sty=1&tpg=35&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?b ...

看到论坛里还是有同学请教克隆的问题，因为在以前的实验室里也经常做克隆，就整理了自己的一点经验，发在这里，希望能抛砖引玉，大家踊跃来讨论。实验的过程和标准过程差不多，只不过有些改进，缩短了一些步骤的时长。实验室常讲的克隆，意思是将一段序列连接到细菌（一般是大肠杆菌）的DNA中，随着大肠杆菌的不断繁殖，而达到使目标序列无限复制的目的。明确概念后，要讲讲克隆在实验室中到底有什么作用。最常见的是：1.要测序的PCR产物条带 ...

N摘要：荧光条形码标记的单分子检测技术是一种全新的高通量检测基因表达谱、miRNA等分子的技术，其定量结果可与real-time PCR相媲美。由于它的高通量和高精确性填补了基因芯片和real-time PCR之间的技术空白，一经问世大受欢迎，其检测结果频频登载在nature、science、cell等顶级杂志上。NanoString公司研发的荧光条形码标记的单分子检测技术最早诞生于Leroy Hood博士创立的系统生 ...

我要扩增一种逆转录病毒（)的某段基因。将这段基因用RT-PCR方法扩出来后，再用pcDNA3.1转到Hela细胞中，观察它对细胞一些表达产物具有正向还是负相的调节作用。基因序列如下：1 atggaacaag ccccagaaga ccaagggcca cagagggagc cacacaatga atggacacta61 gagcttttag aggagcttaa gaatgaagct gttagacatt ttcctaggat ttggctccat121 ...

1 gttaaaaatc tatagagatg gacactatcg ccgcaagagc actcactgtg atgcgagcat61 gtgctacgct tcaagaggca agaattgtgt tggaagccaa tgtgatggaa attttgggga121 tagctatcaa taggtacaat ggactcactt tacgaggagt gacgatgcgc ccgacctcgt181 tagcacaaag aaatgagatg ttttttatgt gtt ...

使用Exicycler 96发表的文章Ref.#Reference1Dissection of the essential steps for condensin accumulation at kinetochores and rDNAs during fission yeast mitosisNorihiko Nakazawa, Takahiro Nakamura, Aya Kokubu, Masahiro Ebe, Koji Nagao and Mitsuhoro Yanagida.J Cell Biol. 2008 Mar 2 ...

我的课题涉及到CYP1A1的多态，从文献上（cancer res等级别的文章，而且重复的人挺多）查到它的一个MspI多态位点引物为5’-CAG TGA AGA GGT GTA GCC GCT-3＇和5’-TAG GAG TCT TGT CTC ATG CCT-3’，但我有扩增出了其他引物的条件都没有能扩增出这对引物的目标带，做梯度从48到65度都没有带出来。下面是所查的该引物的Blast的资料和该基因这个位点的基因序列资料，请高手帮忙分析一下到底这对引物可不可以扩 ...

我想作RT-PCR，扩一个长度为1352kb的基因，用pcDNA3.1作载体表达。我要得到cdna全长，不知道应该怎么设计引物和酶切位点。mrna序列如下CAGGCTCTGTGTTGGTTGGAGCGAGCATGTGGGTCTGCAGTACCCTGTGGCGGGTGCGAACCCCGCCCGGCAGTGGCGGGGGCCTGCTCCCAGCTTCTGGCTGTCACGGACCTGCCGCCTCCTCCT ...

Cleavage Efficiency Close to the Termini of PCR FragmentsWhen designing PCR experiments in which the synthesized DNA fragment is to be subsequently digested with a restricton endonuclease, it is very important to determine how many extra nucleotides should be added to the 5'-end of the PCR pr ...

PCR条件对反应的影响变性温度与时间模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况下可设为94℃20-30秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热DNA聚合酶的活性，最高变性温度不宜超过95℃。退火温度与时间退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强， ...

我最近跑pcr,用我的模板第一次跑出来，可后来始终不见条带。我的目的片断序列如下：ORIGIN1 accgcctccc gcaaagactt caccccaaag ctggggcgca ccccttgcac gccaccctcc61 ccccagcctg cttcttgagt cccccgcatc ccaggaccct ctctcctctg ggaggccgat121 ctccctcgga cctgctggca atagcttcct atttaagaac acccca ...

全血基因组提取过程包括：1 、裂解红细胞并沉淀白细胞。2 、裂解白细胞及其细胞核。3 、盐析沉淀蛋白，分离基因组。4 、异丙醇沉淀脱盐并浓缩。5 、70%乙醇清洗，晾干并用TE缓冲液溶解。本试剂提取的基因组DNA长度大于20kb, 可用于PCR扩增、内切酶消化以及膜杂交等。一、 试剂盒组成 （本试剂盒提供的试剂组分, 至少可提取20份300ul全血样本的，每种组分均有足够的富余量）1． 红细胞裂解液：20ml/1瓶。 4. TE 缓冲液（DNA溶解液）：4ml/1瓶。2． 细胞 ...

tg tctgggtctt gcacaatgac119521 aatgggtccc tgtttttccc agaggctctt ttgttctgca gggattgaag acactccagt119581 cccacagtcc ccagctcccc tggggcaggg ttggcagaat ttcgacaaca catttttcca119641 ccctgactag gatgtgctcc tcatggcagc tgggaaccac tgtccaataa gggcctgggc ...

我的试验动物是猪，在网上查的HIF的基因不是全序列，对引物设计有影响吧，如果这样不能得到引物我该怎样办？我急用求高人指点LOCUS AY485675 569 bp mRNA linear MAM 23-DEC-2003DEFINITION Sus scrofa hypoxia-inducible factor 1 alpha mRNA, partial cds.ACCESSION AY485675VERSION AY485675.1 GI:40037189KEYWORDS .SOURCE ...

就小量RNA的检测而言，与传统的RNA定量检测手段（如RNA印迹分析）相比，逆转录实时定量PCR(qRT-PCR)更为灵敏。实际上，这一技术足以定量单细胞的RNA水平。qRT-PCR应用的主要限制因素是结果的高不稳定性，这源于实验所用生物系统的不同，RNA提取方式的多样化以及逆转录反应和PCR效率的差异。 所有这些变量都使得实时定量PCR结果难以进行标准化处理。用于量化qRT-PCR结果的策略不止一种。其中的一种方法 ...

碱裂解法抽提质粒原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3M醋酸钾 / 2 M醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50mM葡 ...

一个PCR相关的专业网站，内容很全http://www.pcrlinks.com/实验方法与步骤详解http://swjsx.ntmc.edu.cn/Protocol/home.htm美国AXYgen公司http://www.axygen.com/NewFiles/pcr.htmlhttp://www.alkami.com/This 158 page PCR manual covers the following topicsPCR Primer designPCR M ...