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        质粒转染法

        相关实验:质粒转化大肠杆菌

        最新修订时间:

        原理

        感受态细胞易于接受外来基因成为重组细胞,实验将质粒加入有感受态细胞的培养皿中,热击处理进行质粒转染。

        材料与仪器

        步骤

        一、转染


        1. 从-70℃ 冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。


        2. 加入质粒 DNA 溶液(含量不超过 50ng,体积不超过 10μl),轻轻摇匀,冰上放置 30 分钟后。


        3.42℃ 水浴中热击 45s/90s,热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。


        4. 向管中加入 1 mlLB 液体培养基(不含 Amp),混匀后 37℃ 振荡培养 1 小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。


        5. 将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃ 培养 16-24 小时。


        6.在转染的同时应做两个对照:

        对照组 1:以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。

        对照组 2:以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,但涂板时只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。


        二、转染大肠杆菌的扩增


        1. 从 LB 平板上挑取新活化的单个菌落,接种于 3-5 mlLB 液体培养基中,37℃ 下振荡培养 12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50 的比例接种于 100 mlLB 液体培养基中,37℃ 振荡培养 2-3 小时至 OD600=0.5 左右。


        2. 取上述培养液置于冰中 10 min,之后转移到已灭菌的 50 ml 离心管中再于冰上放置 5 min


        3. 于 4℃ 离心,2700rmp,10 min,弃上清,收集细菌


        4. 质粒的提取


        准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液


        5. 质粒鉴定(琼脂糖凝胶电泳)


        三、质粒转染细胞株的建立


        1. 准备细胞:


        贴壁细胞:转染前 24 h,在 500 uL 无双抗完全培养基中接种 0.5~2×105个细胞,转染时细胞融合度为 80 ~ 90% 。 


        2.对于每个转染样品,按下面的方法准备:


        (1)用 50 uL Opti-MEM 稀释 0.8 ug 质粒 DNA,轻轻吹吸 3 - 5 次混匀,室温下静置 5 min。


        (2)轻轻颠倒混匀转染试剂,用 50 uL Opti-MEM 稀释 2.0 uL Lipofectamine TM2000,轻轻吹吸 3 - 5 次混匀,室温下静置 5 min。


        (3)混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液,轻轻吹吸 3 - 5 次混匀,室温下静置 20 min。注: 转染复合物一旦形成,应立即加入培养皿中进行细胞转染。


        (4) 转染复合物加入到 24 孔细胞板中,100 uL/孔,前后轻摇细胞板混合均匀。


        (5) 将细胞板置于 37℃、5% CO2培养箱中培养 6 h 左右,进行换液,换成含 10% 血清的普通培养基,在 37℃,5%CO2 孵育箱中继续培养 24 h 左右。


        四、稳定转染细胞株的筛选


        1.从 37℃,5%CO2孵育箱中取出培养皿,弃去含转染试剂的培养基,用 PBS 冲洗细胞 2 遍,胰蛋白酶消化,接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中,加入含 500 ug/ml G418 的新鲜培养基,每 2-3 天更换一次新的筛选培养基,每天观察细胞的死亡情况。


        2.当正常细胞完全死亡后,换用新的不含 G418 的培养基培养。每天观察细胞生长状态。


        3.在细胞达到 60% 汇合率时再用含 500 ug/ml G418 的培养基筛选一次。


        4.当细胞达到 90% 以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养(转染后 10~12 天左右)。以后每隔 4~5 天再用含 500 ug/ml G418 的培养基筛选。


        5.直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品(约转染后 15 天左右)。以后继续培养时加入的 G418 浓度降一半。


        注意事项

        铺板时要将细胞消化完全混匀,避免细胞堆积生长。

        常见问题

        1.LB 培养基的配制:在 950 ml 去离子水中加入:胰化蛋白胨 10 g,酵母提取物 5 g,NaCl10 g,摇动容器直至溶质溶解。用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0,用去离子水定容至 1L,在 15psi 高压下蒸汽灭菌 20 min。


        2.LB 固体培养基及倒板:


        (1)配制:100 mlLB 培养基加入 1.5 g 琼脂粉


        (2)抗生素的加入:高压灭菌后,将融化的 LB 固体培养基置与 55℃ 的水浴中,待培养基温度降到 55℃ 时(手可触摸)加入氨苄抗生素(终浓度为 50 μg/ml),以免温度过高导致抗生素失效,并充分摇匀。


        (3)倒板:一般 10 ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后,打开盖子,在紫外下照 10-15 分钟。


        (4)保存:用封口胶封边,并倒置放于 4℃ 保存,一个月内使用。

        来源:丁香实验

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