• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        用 GST 融合蛋白检测蛋白质-蛋白质相互作用实验

        相关实验:用 GST 融合蛋白检测蛋白质-蛋白质相互作用实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        材料

        缓冲液和溶液
        将缓冲液稀释到适当浓度。

        碱性缓冲液
        20 mmol/L HEPES(pH7.5)
        50 mmol/LKCl
        10 mmol/LMgCl2
        1 mmol/L 二硫苏糖醇
        0.1%NP-40

        封闭缓冲液
        5% 脱脂奶粉于碱性缓冲液中

        相互作用缓冲液
        1% 脱脂奶粉于碱性缓冲液中

        2xPK 缓冲液
        100 mmol/LKPO4(英文版原书如此—译者注)
        20 mmol/LMgCl2
        10 mmol/LNaF
        9 mmol/L 二硫苏糖醇

        还原型谷胱甘肽(20 mmol/L) 于 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中
        可选,请见步骤 3

        洗涤缓冲液 1
        磷酸缓冲盐溶液,含 0.2%TritonX-100

        洗涤缓冲液 2
        磷敢缓冲盐溶液,含 0.2%TritonX-100 和 100 mmol/LKCl

        酶及缓冲液

        蛋白酶
        可选,请见步骤 3。

        蛋白激酶 A
        每次使用时按产品说明新鲜配制。

        放射活性化合物

        [y-32P]ATP(6000Ci/mmol)

        专用设备

        与待筛选蛋白结合的膜或滤膜。
        请见步骤 5。

        Sephadex G-50 转柱
        可选,请见步骤 4。

        附加试剂

        此方案步骤 3 需要一些试剂,它们可将融合蛋白从其载体上或结合的谷胱甘肽-琼脂糖上切割下来,见 15 章方案 5。
        此方案步骤 5 需要含待检测蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶(请见附录 8) 或含 cDNA 表达文库的板(请见 14 章方案 2),以及附录 8 中描述的免疫印迹试剂。
        单独的 GST 或一种非特异性蛋白质的阴性对照应当和靶蛋白一起加入到 SDS 聚丙烯酰胺凝胶中。如果目标蛋白是一保守家族的成员,目标蛋白的相互作用可与同一家族的其他蛋白质进行比较。

        载体和菌株

        结合到谷胱甘肽-球脂糖的 GST 融合蛋白
        这一方案适合于融合蛋白中含蛋白质激酶磷酸化位点的蛋白质(Ron and Dressler 1992)。还可采用含 cAMP 依赖的蛋白激酶识别序列的载体(Amersham Pharmacia Biotech 公司)。如果使用非标记的 GST 融合蛋白,请参见本方案结束处的文本框,“替代方案:用抗 GST 抗体检测蛋白质-蛋白质相互作用”。

        方法

        放射标记蛋白探针的制备

        1. 在微量离心管中制备下列反应混合物:

        [γ-32P]ATP(6000Ci/mmol)                               5ul

        蛋白激酶 A                                                        1unit/ul
         
        在谷胱甘肽琼脂糖上的 GST 融合蛋白               1~3ug

        2XPK 缓冲液                                                       12.5ul

        水                                                                        到 25ul

        反应混合物在 37°C 孵育 30 min。

        在标记反应进行前融合蛋白可被蛋白酶切割。在此情形下,用切割蛋白替代标记反应中结合到谷胱甘肽琼脂糖上的蛋白质,37°C 孵育 30 min, 然后接续步骤 4。
        GST 成分保留在融合蛋白上,要用 GST 本身(结合到谷胱甘肽琼脂糖)做对照重复此实验。在文库筛选时这可能不太实际,因此重要的是测试阳性克隆与 GST 本身结合的能力。这一对照通常在第四次纯化后、克隆鉴定前进行。

        2. 标记反应完成后,加入 200ul 的 1XPK 缓冲液到离心管中清洗琼脂糖珠,然后在微量离心机上以最大速度离心 1 min。用适当的方式将含游离放射性核酸的上清弃去,再重复清洗一次。

        3. 用一种蛋白酶切下标记蛋白质,或用 20 mmol/L 还原型谷胱甘肽于 50 mmol/LTris (pH8.0) 中(请见 15 章方案 5) 将标记的 GST 融合蛋白从琼腊糖珠上洗下。将标记蛋白存放在冰盒中,在同一天中使用。

        4. 在标记反应前如果标记蛋白与 GST 成分分开(请参见步骤 1 的注意事项),就将标记蛋白上用 1XPK 缓冲液平衡的SephadexG-50 柱,以除去游离的标记核酸。探针蛋白一旦与游离核酸分开,就可使用。将标记蛋白存放在冰盒中,在同一天中使用。

        探测膜

        5. 用标准技术将蛋白质转移到膜上,制备待检测的膜。
        从 SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移的蛋白质通常可以直接被检测。如果蛋白质从 cDNA 表达文库中转移,则在进入到步骤 6 之前,可要进行附加方案:“膜结合蛋白的再折叠”。

        6. 用碱性缓冲液完全覆盖膜并在 4°C 轻轻震荡淸洗 10 min。

        7. 弃去碱性缓冲液,用封闭缓冲液完全覆盖膜,并在 4°C 轻轻震荡孵育 4 h 到过夜。

        8. 加人 1~3ug 的贮存探针(来自步骤 3 或 4) 到足够的相互作用缓冲液中,使终浓度为 1~5nmol/L, 制备标记蛋白溶液。将膜转移到含稀释探针的平皿中,确认探针溶液与膜的整个表面均匀接触。4°C 轻轻震荡孵育 4~5 h。

        9. 以适当的方式弃去放射性探针溶液。用洗漆缓冲液 1 完全覆盖膜,并在 4°C 轻轻震荡孵育 10 min。重复洗涤三次。

        10. 用洗涤缓冲液 2 完全覆盖膜,并在 4°C 轻轻震荡洗涤 10 min。重复洗涤一次。

        11. 用塑料包膜小心包裹膜并曝光到 X 光片上。

        用 GST 融合蛋白检测蛋白质-蛋白质相互作用实验
        用 GST 融合蛋白检测蛋白质-蛋白质相互作用实验
        用 GST 融合蛋白检测蛋白质-蛋白质相互作用实验
        用 GST 融合蛋白检测蛋白质-蛋白质相互作用实验

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序