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        GST pull-down 对照试验如何设计?

        相关实验:用 GST 融合蛋白检测蛋白质-蛋白质相互作用实验

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        dxy_yn5g3wy9

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        3 个回答

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        土井挞克树

        有帮助

        一般对照都是采用gst成分保留在融合蛋白上,然后用gst结合在谷胱甘肽琼脂糖作为对照实验

        user-title

        sswei

        有帮助

        做SDS-PAGE时点一个input的蛋白(即B-6*His)阳性对照,看一下Western操作过程中试剂、操作步骤有没有问题

        谷胱甘肽琼脂珠上只固定GST蛋白,inputB-6*His,用于做阴性对照,看一下是否GST会与input的蛋白相互作用

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        下面是进行GST pull-down对照试验的一般设计步骤:

        1. 准备GST融合蛋白:将目标蛋白的编码序列克隆到GST融合表达载体中,然后转染到适当的宿主细胞中进行表达和纯化。这将产生GST融合蛋白,其中GST标签用于后续的亲和纯化。

        2. 准备负对照蛋白:选择一个与目标蛋白无已知相互作用的蛋白作为负对照蛋白。可以使用无关蛋白、空载体或已知不与目标蛋白相互作用的蛋白作为负对照。

        3. 制备细胞裂解液:分别表达目标蛋白和负对照蛋白的细胞在适当的缓冲液中裂解,并加入蛋白酶抑制剂以避免蛋白降解。

        4. 亲和纯化:将细胞裂解液通过亲和层析柱(如GST亲和柱)进行纯化,其中GST融合蛋白能够结合到亲和柱上。

        5. 免疫印迹分析:将纯化后的GST融合蛋白和负对照蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离,然后转移到膜上。使用适当的抗体探针(例如抗GST抗体)进行免疫印迹分析,以检测目标蛋白和负对照蛋白的存在。

        6. 结果解读:如果目标蛋白与GST融合蛋白结合,可以观察到目标蛋白在免疫印迹上的信号。负对照蛋白不应该显示与GST融合蛋白的结合。

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