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        如何验证蛋白分泌出细胞并结合在膜上

        相关实验:用 GST 融合蛋白检测蛋白质-蛋白质相互作用实验

        user-title

        dxy_lywi9f05

        在真菌中表达一个目的蛋白并加了信号肽和GFP荧光蛋白,目的蛋白分泌出细胞外,并且可以和细胞膜表面的葡聚糖结合。

        现在细胞膜上可以看到荧光,但是不确定在细胞膜内有荧光还是细胞膜外。

        想请教两点,如何证明目的蛋白分泌出细胞了?以及如何验证目的蛋白结合在真菌细胞膜上的葡糖糖上了?

        有没有科研大神知道用什么方法可以验证?请求大神指导一下,谢谢!


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        2 个回答

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        要证明目的蛋白已经分泌到真菌细胞外,您可以尝试以下方法:

        1. 细胞培养上清液检测:收集培养基中的上清液,通过蛋白质浓度测定、Western blot或ELISA等方法检测目的蛋白的存在。如果目的蛋白在上清液中可检测到,说明它已经被分泌到细胞外。

        2. 免疫荧光染色:对真菌进行固定和免疫染色,使用抗体特异性地与目的蛋白结合,并通过荧光显微镜观察荧光信号。如果荧光信号在细胞外被观察到,可以确认目的蛋白已经分泌到细胞外。

        验证目的蛋白是否结合在真菌细胞膜上的葡聚糖上时,您可以考虑以下方法:

        1. 免疫染色和荧光显微镜:使用抗体特异性地与目的蛋白结合,然后使用荧光标记的二抗检测荧光信号。如果荧光信号在真菌细胞膜上被观察到,那么可以推断目的蛋白与葡聚糖结合。

        2. 细胞壁分离:通过细胞壁分离的方法将细胞壁与细胞膜分离开来,然后使用Western blot等方法检测目的蛋白在细胞壁和细胞膜分离物中的存在。如果目的蛋白仅在细胞膜分离物中可检测到,那么可以推断其与葡聚糖结合。

        user-title

        dxy_mqg1dtg8

        有帮助

        1. 验证目的蛋白是否分泌出细胞。您可以采用细胞培养上清液的ELISA检测方法,检测上清液中是否存在目的蛋白。如果目的蛋白分泌出细胞,则应该能够在上清液中检测到目的蛋白。

        2. 验证目的蛋白是否结合在真菌细胞膜上的葡聚糖上。您可以采用荧光共聚焦显微镜(confocal microscopy)技术进行观察。对于细胞膜表面的葡聚糖,您可以使用荧光标记的葡聚糖结合物(如WGA-Alexa Fluor 488)来标记,观察目的蛋白是否与其共定位。如果目的蛋白与葡聚糖结合,则应该能够在细胞膜表面观察到荧光信号的重叠。

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