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        相对 RT-PCR: 引物与竞争子比例的决定实验

        相关实验:相对 RT-PCR: 引物与竞争子比例的决定实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        去除 RNA 酶的双蒸水

        10XRT-PCR 缓冲液(100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)

        2. 酶和酶缓冲液

        Taq DNA 聚合酶(5U/ul)

        3. 核酸和寡核苷酸

        cDNA(来自方案 1)

        dNTP 混合物(10 mmol/L, 包含所有四种 dNTP)

        基因特异的正向引物(5umol/L)

        基因特异的反向引物(5umol/L)

        4. 放射性复合物

        [a-32P]dCTP(10uCi/ul)(1Ci=37 GBq)

        5. 实验器材

        Quantum RNA Universal 18S standards(Ambion; 包括 18SPCR 引物对和 18SPCR 竞争子)

        薄壁的 PCR 管

        6. 专用仪器

        可编程的 PCR 仪

        二、方法

        1.引物与竞争子的比例如下。

        相对 RT-PCR: 引物与竞争子比例的决定实验

        2.在冰上准备 PCR 反应混合物 。

        cDNA                                             5.5ul

        10XRT-PCR 缓冲液                       27.5ul

        10 mmol/LdNTP 混合物                 22ul

        5U/ulTaqDNA 聚合酶                     1.4ul

        去除 RNA 酶的 ddH2O                   177ul

        [a-32P]dCTP(10uCi/ul)                   2.5ul

        3.平均在每个 PCR 管中加入 42ulPCR 反应混合物,共 5 管,分别标记 1~5。

        4.在 1~4 管中,分别在每个管中加 2ul 基因特异的正向引物(5umol/L) 和 2ul 基因特异的反向引物(5umol/L)。

        5.如下所示加入 18SrRNA 引物和竞争子的混合物。

        在 2 号管中加入 1:9 混合物 4ul

        在 3 号管中加入 2:8 混合物 4ul

        在 4 号、5 号管中加入 3:7 混合物 4ul

        6.进行 PCR 扩增,如方案 1 所述,使用扩增线性范围决定的最佳循环数。

        7.如方案 1 所述,用变性凝胶电泳来分析实验结果。检测哪一个泳道的 18SrRNA 产物的量最接近基因特异性产物的表达量,这一样品中引物与竞争子的比例在后续的相对 RT-PCR 实验中使用。

        来源:丁香实验

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