原理
尽管辣根过氧化物酶（HRP）可以催化Luminol-H2O2反应体系产生化学发光，但由于该体系的检测灵敏度不够高，不能满足酶联免疫测定的要求。因此，为了提高体系的检测灵敏度，可将HRP催化H2O2氧化曙红（Eosin）的反应与该反应产物增强HRP催化luminol-H2O2的化学发光反应相偶合，建立偶合放大化学发光酶联免疫分析法。这里，酶的活性是基于下列发光反应进行检测的
HRP
luminol＋H2O2───→产物＋hν
产 物
↑
Eosin＋H2O2 ────┘
HRP
↑
Eosin＋H2O2 ────┘
HRP
血清中HBsAg含量越高，结合的酶标抗体越多,则偶合放大化学发光强度越强；反之亦然。因此，可以根据检测到的化学发光光强度来间接定量人血清中HBsAg的水平。
材料与仪器
步骤
1. 包被抗体
在每个小试管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300 μl用0.05 M，PH9.6 碳酸盐缓冲液稀释的抗HBsAg抗体，同时设空白对照，置4 ℃过夜。
2. 洗涤
用抽滤针头吸干管内液体，加入Tris-HCl-Tween20洗涤3 次，每次加2 ml，放置3～5 min，用抽滤针头吸干管内液体。
3. 加待检血清和阳性标准品
用PBS-Tween20缓冲液不同倍数稀释HBsAg阳性标准品或待检血清，每管加入300 μl。同时设阴性对照，空白对照管只加抗体稀释液。置37 ℃孵育2 h。
4. 洗涤
同2。
5. 加酶标抗体
用含小牛血清的PBS-Tween20缓冲液稀释HRP标记的抗HBsAg抗体，每管加入300 μl，空白对照管只加用于稀释酶标抗体的稀释液。置37 ℃孵育2 h。
6. 洗涤
同2。
7. 化学发光测定
给每管加入300 μl底物溶液，置37 ℃保温20 min。然后将小试放入LKB-1250 lumimeter中，并置于测量位置，加入300 μl 5.0×10－4 M luminol。记录仪记录化学发光强度。
8. 同时用ELISA方法进行对照，结果测量采用DG3022型酶联免疫检测仪。
在每个小试管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300 μl用0.05 M，PH9.6 碳酸盐缓冲液稀释的抗HBsAg抗体，同时设空白对照，置4 ℃过夜。
2. 洗涤
用抽滤针头吸干管内液体，加入Tris-HCl-Tween20洗涤3 次，每次加2 ml，放置3～5 min，用抽滤针头吸干管内液体。
3. 加待检血清和阳性标准品
用PBS-Tween20缓冲液不同倍数稀释HBsAg阳性标准品或待检血清，每管加入300 μl。同时设阴性对照，空白对照管只加抗体稀释液。置37 ℃孵育2 h。
4. 洗涤
同2。
5. 加酶标抗体
用含小牛血清的PBS-Tween20缓冲液稀释HRP标记的抗HBsAg抗体，每管加入300 μl，空白对照管只加用于稀释酶标抗体的稀释液。置37 ℃孵育2 h。
6. 洗涤
同2。
7. 化学发光测定
给每管加入300 μl底物溶液，置37 ℃保温20 min。然后将小试放入LKB-1250 lumimeter中，并置于测量位置，加入300 μl 5.0×10－4 M luminol。记录仪记录化学发光强度。
8. 同时用ELISA方法进行对照，结果测量采用DG3022型酶联免疫检测仪。
注意事项
1. 洗涤要彻底，以免因血清中其他来源的过氧化物酶类物质所产生的非特异性反应，而影响测定结果。
2. 实验中，应分别设置阳性、阴性、空白对照来控制实验条件，且每份样品均应做三个复管，以保证实验结果的准确性。
3. 为了克服酶标抗体因非特异性吸附而造成的较高本底，可用适量小牛血清加以抑制。
4. 当加入luminol后，迅速产生化学发光并使发光在一秒钟内达到峰值，然后很快衰减到基线水平。因此，只有当小试管置于仪器的测量位置时，方可加入luminol。
5. 底物的加入，是为了增强化学发光强度。但只有当底物分子与酶催化活性中心充分接触时，反应速度才能加快。当反应进行15 min达到平衡时，牷学发光强度则不再随时间的延长而变化，且在1 h内保持稳定，因此，控制底物与酶反应15 min后加luminol进行化学发光测定。
2. 实验中，应分别设置阳性、阴性、空白对照来控制实验条件，且每份样品均应做三个复管，以保证实验结果的准确性。
3. 为了克服酶标抗体因非特异性吸附而造成的较高本底，可用适量小牛血清加以抑制。
4. 当加入luminol后，迅速产生化学发光并使发光在一秒钟内达到峰值，然后很快衰减到基线水平。因此，只有当小试管置于仪器的测量位置时，方可加入luminol。
5. 底物的加入，是为了增强化学发光强度。但只有当底物分子与酶催化活性中心充分接触时，反应速度才能加快。当反应进行15 min达到平衡时，牷学发光强度则不再随时间的延长而变化，且在1 h内保持稳定，因此，控制底物与酶反应15 min后加luminol进行化学发光测定。
常见问题
一、结果判定
1. 定性
按下列公式判别阴、阳性
2. 定量
以不同稀释度的HBsAg阳性标准品的化学发光强度为纵坐标，不同稀释倍数为横坐标，作出剂量反应曲线（标准曲线），待测样品中HBsAg的含量就可由测量的化学发光强度换算得到。
按下列公式判别阴、阳性
L样品－L空白 ┌≥2.1 为阳性
S/N ＝ ──────── ＝ 商│
L阴性对照－L空白 └＜2.1 为阴性
2. 定量
以不同稀释度的HBsAg阳性标准品的化学发光强度为纵坐标，不同稀释倍数为横坐标，作出剂量反应曲线（标准曲线），待测样品中HBsAg的含量就可由测量的化学发光强度换算得到。
来源：丁香实验
