原理
BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素（B）与亲和素（A）间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68 kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力（结合常数高达1015M-1）。生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。
材料与仪器
步骤
一、用于检测未知抗原的BA-ELISA
2. 加样
加入待检样品（未知抗原）或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔，阴性和阳性孔对照。37 ℃孵育1 小时，洗涤。
3. 加B-Ab
已作适当稀释的生物素化抗体（B-Ab），加于每孔0.1 ml，37 ℃孵育30～60 分钟。洗涤。
4. 加A-HRP
已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素（A-HRP），于每孔加0.1 ml，37 ℃孵育30～45 分钟。洗涤4 次。
5. 底物显色
于上述各反应孔中加入临时配制的TMB（或OPD）底物应用液0.1 ml，于37 ℃10～30 分钟。再加2 M H2SO4 0.05 ml以终止反应。
6. 结果判定
目测或在ELISA比色仪上测OD值。
1. 包被抗原
用0.05 M PH9.6 碳酸盐缓冲液将已知的抗原作适当稀释，于聚苯乙烯酶标板的孔中加0.1 ml，4 ℃18-24 小时。用洗涤缓冲液洗3 次，每次3 分钟。
1. 包被抗体
用0.05 M PH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1 ml，4 ℃过夜（18-24小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 分钟（简称洗涤，下同）。
用0.05 M PH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1 ml，4 ℃过夜（18-24小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 分钟（简称洗涤，下同）。
2. 加样
加入待检样品（未知抗原）或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔，阴性和阳性孔对照。37 ℃孵育1 小时，洗涤。
3. 加B-Ab
已作适当稀释的生物素化抗体（B-Ab），加于每孔0.1 ml，37 ℃孵育30～60 分钟。洗涤。
4. 加A-HRP
已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素（A-HRP），于每孔加0.1 ml，37 ℃孵育30～45 分钟。洗涤4 次。
5. 底物显色
于上述各反应孔中加入临时配制的TMB（或OPD）底物应用液0.1 ml，于37 ℃10～30 分钟。再加2 M H2SO4 0.05 ml以终止反应。
6. 结果判定
目测或在ELISA比色仪上测OD值。
二、检测未知抗体的BA-ELISA程序
1. 包被抗原
用0.05 M PH9.6 碳酸盐缓冲液将已知的抗原作适当稀释，于聚苯乙烯酶标板的孔中加0.1 ml，4 ℃18-24 小时。用洗涤缓冲液洗3 次，每次3 分钟。
2. 加样
加适当稀释的待检样品（未知抗体）于反应孔中，同时作空白、阴性和阳性对照孔。37 ℃孵育1 小时，洗涤。
加适当稀释的待检样品（未知抗体）于反应孔中，同时作空白、阴性和阳性对照孔。37 ℃孵育1 小时，洗涤。
3. 加B-Ab2
加稀释过的生物素化抗抗体（抗人或鼠等的IgG），每孔0.1 ml， 37 ℃30-60 分钟，洗涤。
加稀释过的生物素化抗抗体（抗人或鼠等的IgG），每孔0.1 ml， 37 ℃30-60 分钟，洗涤。
4. 余下步骤同测未知抗原的BA-ELISA。
注意事项
1. 反应物的浓度及比例
由于本法敏感性很高，牥括所用抗原或抗体均较ELISA法为少，对生物素标记的抗体（或第二抗体）的浓度更应严格掌握，增加抗体浓度可使敏感性提高，但过大又可使非特异性随之增大。
2. 生物素的稳定性
生物素标记上抗体的结合物，其稳定性均比酶标记抗体为好，宜长期保存，加入等量60 ％甘油于-20 ℃可保存2年左右。保存时切忌反复冻融，反复冻融会使制剂的活性受到损害。
3. 亲和素的稳定性
亲和素在一般条件下稳定，对热及多种蛋白质能耐受，但在某些金属离子存在下对光敏感，容易失活。所以在配制亲和素溶液时宜采用无离子水，在4 ℃置2 个月或在-30 ℃置放半年，反复冻融其活性仍保持不变。
4. 亲和素的非特异性吸附
亲和素在PH中性环境中是带正电荷的，可通过静电作用非特异性地吸附到固相载体上，这是引起试验非特异性显色的主要原因。如果增加亲和素稀释液的PH和离子强度，均可明显减少亲和素的非特异性吸附，而对特异性显色也影响不大。也可用戊二醛或醋酸酐对亲和素进行化学修饰，使之乙酰化而减少其非特异性吸附。
5. 反应物的作用时间及温度
由于亲和素与生物素之间有很高亲和力，故二者标记物反应时间较抗原-抗体反应时间大为缩短。为了减少非特异性吸附，反应时间不宜过长，一般于37 ℃以20-30 分钟为宜。
由于本法敏感性很高，牥括所用抗原或抗体均较ELISA法为少，对生物素标记的抗体（或第二抗体）的浓度更应严格掌握，增加抗体浓度可使敏感性提高，但过大又可使非特异性随之增大。
2. 生物素的稳定性
生物素标记上抗体的结合物，其稳定性均比酶标记抗体为好，宜长期保存，加入等量60 ％甘油于-20 ℃可保存2年左右。保存时切忌反复冻融，反复冻融会使制剂的活性受到损害。
3. 亲和素的稳定性
亲和素在一般条件下稳定，对热及多种蛋白质能耐受，但在某些金属离子存在下对光敏感，容易失活。所以在配制亲和素溶液时宜采用无离子水，在4 ℃置2 个月或在-30 ℃置放半年，反复冻融其活性仍保持不变。
4. 亲和素的非特异性吸附
亲和素在PH中性环境中是带正电荷的，可通过静电作用非特异性地吸附到固相载体上，这是引起试验非特异性显色的主要原因。如果增加亲和素稀释液的PH和离子强度，均可明显减少亲和素的非特异性吸附，而对特异性显色也影响不大。也可用戊二醛或醋酸酐对亲和素进行化学修饰，使之乙酰化而减少其非特异性吸附。
5. 反应物的作用时间及温度
由于亲和素与生物素之间有很高亲和力，故二者标记物反应时间较抗原-抗体反应时间大为缩短。为了减少非特异性吸附，反应时间不宜过长，一般于37 ℃以20-30 分钟为宜。
来源：丁香实验
