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        免疫斑点试验

        相关实验:标记抗体的应用技术

        最新修订时间:

        原理

        硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力,在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。因而,将抗原吸附于纤维素膜后,就可利用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。当加入抗体后(即可与膜上的抗原结合),然后再加入带有标记物的抗体,使标记通过抗抗体和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。加入标记物相应的底物后,标记物即可与底物作用形成不溶性产物,呈现斑点状着色,从而判定结果。根据所用的标记物不同,可分为:辣根过氧化物酶免疫斑点试验(使用辣根过氧化物酶作为抗抗体的标记物),碱性磷酸酶免疫斑点试验(使用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物作为酶标记物)和金银染色免疫斑点试验(使用胶体金作为抗抗体的标记物)等。其中,最常用的是以辣根过氧化物酶标记系统为基础的免疫斑点试验。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        一、辣根过氧化物酶免疫斑点试验
               
        1.  将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl
        点于硝酸纤维素膜(或醋酸纤维素膜)上
                       
        2.  置37 ℃温箱中干燥20~30 分钟
                       
        3.  滴加封闭液37 ℃温盒中封闭10 分钟
                       
        4.  用洗涤液洗1~2 次,滤纸吸干
                   
        5.  加用稀释液稀释的抗体或待检标本,置37 ℃湿盒中30 分钟
                 
        6.  用洗涤液震洗3 次×3 分钟、吸干
                   
        7.  水洗终止反应,观察结果。出现明显综色斑点者为阳性

        二、碱性磷酸酶免疫斑点试验
               
        1.  将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl
        点于硝酸纤维素膜上
                    
        2.  置37 ℃温箱中干燥20~30 分钟
                       
        3.  用封闭液37 ℃湿盒中封闭10 分钟
                     
        4.  用洗涤液震洗1~2 次,滤纸吸干

        5.  加稀释液稀释的小鼠抗体或待检标本,置室温湿盒中30 分钟
                       
        6.  用洗涤液震洗3 次×3 分钟,吸干
                 
        7.  加1∶50稀释的兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG血清,置室温湿盒中30 分钟、洗同前、吸干
                   
        8.  加APAAP复合物于膜上、室温湿盒中30 分钟,洗同前、吸干
               
        9.  加1∶50稀释的抗鼠IgG血清,置室温湿
        盒中10分钟,震洗1次、吸干
                   
        10.  加APAAP复合物,温育、洗涤同“9”
                       
        11.  重复“9”和“10”1~3次
                      
        12.  洗涤液震洗3次×3分钟、吸干
            
        13.  滴加新配底物溶液显色5~10分钟,水洗中止反应,观察结果

        注意事项

        一、免疫斑点试验的影响因素 

        1.  包被N、C膜的抗原浓度对试验结果影响较大。多以蛋白质含量500~
        1000 μg/ml为宜。浓度过高可出现假阳性,过低则降低试验的敏感性。
          
        2.  酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最适浓度常与包被抗原浓度有
        关,应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。
          
        3.  显色时间,一般认为5-10 分钟较好。显色时间过长常导致本底着色加深,降
        低试验的特异性。
          
        4.  用抗原包被NC检测抗体时,待检样品加样不宜过多。加样过多可使相邻的
        样品混淆,一般5~10 μl即可。

        来源:丁香实验

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